藍(lán)漿果葉片再生不定芽的伸長研究

（合肥植物園，安徽合肥 230031）

藍(lán)漿果為杜鵑花科越桔屬植物，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，我國南北均有種植[1-3].組培是藍(lán)漿果進(jìn)行快速繁殖和培育優(yōu)選系的有效方法[4]，不定芽伸長生長是葉片再生中一個非常關(guān)鍵的步驟，剛形成的芽很小，如不能實(shí)現(xiàn)芽的伸長生長，小芽極易干枯死亡[5].芽能否很好的伸長生長直接決定無根試管苗的生根狀況.本試驗(yàn)在芽增殖的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步促進(jìn)經(jīng)切割后叢生芽的生長與伸長，分析了激素、培養(yǎng)基、光強(qiáng)、不定芽芽齡以及基因型對不定芽伸長的影響，探索最適伸長條件，為藍(lán)漿果組織培養(yǎng)進(jìn)一步發(fā)展提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試材料由葉片誘導(dǎo)生長30 d（不定芽芽齡影響試驗(yàn)除外）的南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)18 等的不定芽.其中基因型對不定芽影響的研究中所用材料為兔眼藍(lán)漿果品種“園藍(lán)”、“梯芙藍(lán)”、“燦爛”、“精華”、“巴爾德溫”、“藍(lán)美人”與南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)17、A167、A119 葉片 培養(yǎng)伸長不定芽；激素、培養(yǎng)基、光強(qiáng)、不定芽芽齡對不定芽伸長影響研究均采用南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)18 的不定芽為材料.

1.1.2 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基為WPM（不同培養(yǎng)基處理除外），在培養(yǎng)基中加入蔗糖25 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1、ZT 0.5 mg·L-1(不同激素處理除外)，pH值調(diào)至5.3.配制好的培養(yǎng)基經(jīng)常規(guī)滅菌后備用.

1.2 方法

取大小約0.5 cm2的不定芽芽塊36 塊，接種于培養(yǎng)基上，每個處理塊于溫度（25±2）℃、光照度1800～2000 lx、光照時間16 h·d-1的條件下培養(yǎng).每天觀察并記錄不定芽生長情況，40 d 天后統(tǒng)計伸長芽塊數(shù)、伸長枝條數(shù)、平均苗高及對枝條進(jìn)行形態(tài)描述.

1.2.1 激素對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

選取激素如下：ZT（0.2、0.4、0.8 mg·L-1）；2ip(0.5、1、2 mg·L-1)；NAA (1 mg·L-1)、2ip+NAA(1+0.1 mg·L-1)；ZT+NAA(0.4+0.1 mg·L-1)；對照（不添加任何激素）.

1.2.2 基本培養(yǎng)基對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

試驗(yàn)培養(yǎng)基分別為WPM、MWPM、MS、1/2MS.

1.2.3 光照強(qiáng)度對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

光照強(qiáng)度處理分別設(shè)置為全暗（0）、弱光（0～500 lx）、中光（1000～1500 lx）、強(qiáng)光（2000～2500 lx）.

1.2.4 不定芽芽齡對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

不定芽芽齡分別為30 d、60 d、90 d.

1.2.5 不同品種（系）藍(lán)漿果再生不定芽伸長的比較

取兔眼藍(lán)漿果品種“園藍(lán)”、“梯芙藍(lán)”、“燦爛”、“精華”、“巴爾德溫”、“藍(lán)美人”；南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)17、A167、A119 葉片培養(yǎng)伸長不定芽為材料.

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

植物激素是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵性物質(zhì)，在葉片再生體系建立的研究中，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素和生長素的種類與比例是激素使用的關(guān)鍵.目前，藍(lán)漿果葉片再生研究中常使用的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)有2ip、ZT、ZR（反玉米素）、ZT 核苷(ZTR)、TDZ、CPPU、6-BA 等，但不同的種和品種對以上各激素的反應(yīng)相差很大[6-7].從表1可知，不同激素對不定芽伸長的影響不同.其中，低濃度的ZT、2ip 及ZT、NAA 配比對不定芽伸長效果較好，其中不定芽伸長率及伸長枝條數(shù)最高的激素處理為質(zhì)量濃度為0.8 mg·L-1的ZT，不定芽伸長率及伸長枝條數(shù)最低為2ip（1 mg·L-1）和NAA（0.1 mg·L-1）配比（見圖1-5）.伸長枝條苗高及質(zhì)量以質(zhì)量濃度為0.5～1 mg·L-12ip 及0.2～0.8 mg·L-1ZT 的效果較好，而誘導(dǎo)質(zhì)量較差的激素濃度為2ip（1 mg·L-1）和NAA（0.1 mg·L-1）組合.結(jié)果表明，對不定芽伸長誘導(dǎo)效果最好的激素處理為0.8mg·L-1的ZT.

表1 激素對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

表2 培養(yǎng)基對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

2.2 培養(yǎng)基對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

從表2 可知，培養(yǎng)基對不定芽伸長有一定影響.其中，伸長率最高的培養(yǎng)基為WPM，達(dá)41.67%，伸長枝條數(shù)為16；伸長率最低的培養(yǎng)基為1/2MS，低至0（見圖1 之8）.平均苗高以MWPM 及MS 誘導(dǎo)效果好.可見，對不定芽伸長效果最好的培養(yǎng)基為WPM.

2.3 光照強(qiáng)度對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

由表3 可知，在強(qiáng)光和中等光下，不定芽能伸長，強(qiáng)光下伸長率稍高，達(dá)16.67%，伸長枝條數(shù)6，但平均苗高較低，為0.48 cm，但枝條長勢較好；中等光下，伸長率稍低，為5.56%，伸長枝條數(shù)2，平均苗高較高，為1.25 cm，枝條長勢較差（見圖1 之7）.可見，光照強(qiáng)度對不定芽伸長有影響，強(qiáng)光較利于不定芽伸長，弱光及全暗情況下不定芽不伸長.

表3 光照強(qiáng)度對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

2.4 不定芽芽齡對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

由表4（見下頁）可知，培養(yǎng)60 d 的不定芽伸長率較高，伸長枝條數(shù)較多，平均苗高中等；培養(yǎng)90 d 的不定芽與培養(yǎng)30 d 的不定芽伸長率相差不大，但伸長枝條質(zhì)量以培養(yǎng)30 d 效果較好（見圖1 之6）.綜合而言，不定芽芽齡對不定芽伸長效果有影響，培養(yǎng)60 d 不定芽較易伸長.

圖1 藍(lán)漿果葉片再生不定芽伸長情況

表4 不定芽芽齡對藍(lán)漿果再生不定芽伸長的影響

2.5 不同品種（系）藍(lán)漿果再生不定芽伸長的比較

由表5 可知，兔眼藍(lán)漿果“園藍(lán)”、“梯芙藍(lán)”、“巴爾德溫”及南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)167、A119 較易伸長，伸長率較高，伸長枝條數(shù)較多；而平均苗高及伸長枝條質(zhì)量以南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)167、A119 較好；伸長能力最差的為兔眼藍(lán)漿果“藍(lán)美人”及南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)17，伸長率低至2.78%；其他品種不定芽伸長能力居中（見圖1 之9）.可見，基因型不同，不定芽伸長能力不同，南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)167、A119 不定芽較易伸長.

表5 不同品種（系）藍(lán)漿果再生不定芽伸長的

3 結(jié)論與討論

在增殖培養(yǎng)基上不定芽無法形成正常的再生植株，因此，需將不定芽接種到低濃度的培養(yǎng)基上進(jìn)行伸長.適宜濃度的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)(6-BA、ZT、KT 等)對不定芽的分化、增殖等是必需的，太高濃度的細(xì)胞分裂素易造成不定芽不易伸長及形成畸形芽，而適當(dāng)濃度的生長素類物質(zhì)(NAA、2，4-D、IAA 等)則對伸長具有一定的促進(jìn)作用.羅素蘭等[8]認(rèn)為，不定芽伸長難的主要原因是由于其內(nèi)源生長素水平較低，營養(yǎng)成分較缺乏，如離體培養(yǎng)時無外源生長素和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)物營養(yǎng)成分的補(bǔ)充就會出現(xiàn)叢芽等問題，以致成苗率較低.楊國順[9]認(rèn)為不定芽伸長率低的原因不是不定芽難以伸長，而是能否分化出完全不定芽而非葉狀體.劉娟旭[10]等認(rèn)為不定芽分化不完全可能與植物生長調(diào)節(jié)劑或營養(yǎng)成分有關(guān)，過多或過少均不利于完全不定芽的形成.在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將不定芽轉(zhuǎn)至不添加生長素，添加低濃度的ZT、2ip 或添加低濃度的ZT 與NAA 配比的培養(yǎng)基中，不定芽較易伸長，這說明不定芽伸長難的原因是內(nèi)源生長素水平較低，營養(yǎng)成分較缺乏.

培養(yǎng)基的選擇在組培工作中具有很關(guān)鍵的地位，Joshi 等[11]報道含硫酸銅的培養(yǎng)基能極其顯著地提高不定芽的伸長率，多數(shù)研究者認(rèn)為子葉作為外植體其再生能力最強(qiáng)，分化后期需轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基才利于其伸長；Khan 等[12]用苗齡一個月的莖尖和莖段也能誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，或直接分化出芽，進(jìn)而長成小苗，而且自始自終只用一種培養(yǎng)基.在本試驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)WPM 培養(yǎng)基較適宜藍(lán)漿果不定芽伸長培養(yǎng).

將不定芽切取后轉(zhuǎn)接至相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基上，繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，如果轉(zhuǎn)接過遲或不轉(zhuǎn)接，愈傷組織會將培養(yǎng)基中的水分和營養(yǎng)耗盡，不定芽生長受到抑制甚至死亡，適宜的轉(zhuǎn)接時間需把握好.在本研究中發(fā)現(xiàn)不定芽生長60 d 時為最佳轉(zhuǎn)接時間.

基因型是影響不定芽伸長的主要原因之一，這可能是因?yàn)椴煌贩N內(nèi)源激素含量不同，選擇再生能力強(qiáng)的品種（系）是建立高效再生體系的關(guān)鍵.劉娟旭[10]認(rèn)為不定芽分化率高的品種不一定伸長率高，但不定芽分化率低的品種，芽伸長率都較低.本研究發(fā)現(xiàn)不同品種（系）不定芽伸長能力不同，其中以南方高叢藍(lán)漿果品種“南月”優(yōu)選系A(chǔ)167、A119 較易得到伸長.

關(guān)于光照強(qiáng)度對不定芽伸長影響的研究未曾見報道.本研究發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)適當(dāng)提高光照強(qiáng)度較利于不定芽伸長，這可能是因?yàn)楣猸h(huán)境是影響組培苗光合作用和生長的內(nèi)在因素，而光照弱是有糖組培苗光合機(jī)構(gòu)功能失常的原因之一，適度提高光照可使組培苗結(jié)構(gòu)發(fā)育更好地趨向于光合自養(yǎng).