基于IPA平臺(tái)預(yù)測(cè)龜芍平顫方抗帕金森病的機(jī)制

吳倩 譚莉娟 張炅璐

[摘要] 目的 基于生物信息學(xué)分析平臺(tái)探討龜芍平顫方抗帕金森病的分子機(jī)制。 方法 從1994年4月～2019年12月的中英文數(shù)據(jù)庫（中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中華本草、PubMed、Web of Science、SciFinder Scholar）中獲得龜芍平顫方（龜甲、白芍、川芎、天麻）的化學(xué)成分，并于PubChem數(shù)據(jù)庫中查找該方每種有效成分的人源活性靶蛋白。檢索Gene數(shù)據(jù)庫，查找帕金森病相關(guān)人源基因。將上述靶蛋白與基因上傳至生物信息學(xué)分析平臺(tái)，分析兩者共同涉及的分子網(wǎng)絡(luò)與生物學(xué)通路。 結(jié)果 獲得龜芍平顫方人源活性靶蛋白323個(gè)（龜甲58個(gè)、白芍119個(gè)、川芎72個(gè)、天麻74個(gè)）;獲取帕金森病相關(guān)人源基因392個(gè)。建立上述靶蛋白及基因共同作用的主要分子網(wǎng)絡(luò)，并甄選出G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)通路等10條主要的生物學(xué)通路。 結(jié)論 龜芍平顫方可能通過調(diào)控G-蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)通路等發(fā)揮抗帕金森病作用。

[關(guān)鍵詞] 帕金森病;龜芍平顫方;生物信息學(xué)分析平臺(tái);G蛋白偶聯(lián)受體

[中圖分類號(hào)] R742 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（a）-0011-05

[Abstract] Objective To explore the molecular mechanism of Guishao Pingchan Formula against Parkinson′s disease （PD） based on ingenuity pathway analysis （IPA） platform. Methods The chemical constituents of Guishao Pingchan Formula [Carapax et Plastrum Testudinis （Guijia）， Radix Paeoniae Alba （Baishao）， Rhizoma Ligustici Chuanxiong （Chuanxiong） and Rhizoma Gastrodiae （Tianma）] were searched from China national knowledge infrastructure （CNKI）， viper database （VIP）， China biology medicine disc （CBMdisc）， Chinese materia medica， PubMed， Web of Science， SciFinder Scholar and active target proteins were retrieved from PubChem from April 1994 to December 2019. Meanwhile， PD related genes were retrieved from Gene. Finally， target proteins of Guishao Pingchan Formula and PD related genes were uploaded to IPA platform， and the molecular networks and classical biological pathways involved in them were compared. Results Three hurdred and twenty-three human active target proteins （58 Guijia， 119 Baishao， 72 Chuanxiong， 74 Tianma） and 392 PD related genes were obtained， then a major molecular network in which both were involved were built. Meanwhile， 10 main canonical pathways involved together were selected， such as G-protein coupled receptors signaling. Conclusion Guishao Pingchan Formula might play an anti-PD role by regulating G-protein coupled receptors signaling and other pathways.

[Key words] Parkinson′s disease; Guishao Pingchan Formula; Ingenuity pathway analysis platform; G-protein coupled receptors

帕金森?。≒D）又稱震顫麻痹，是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)生于中老年，我國(guó)65歲以上的老年人發(fā)病率約為1.7%[1]。PD以黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成為病理特征，以肌強(qiáng)直、靜止性震顫等運(yùn)動(dòng)異常為典型表現(xiàn)[2]。左旋多巴類藥物是治療PD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但長(zhǎng)期使用的不良反應(yīng)較大[3-4]。中藥單獨(dú)或聯(lián)合左旋多巴類藥物治療PD已取得一定臨床效果[5-7]。課題組基于臨床實(shí)踐、循證醫(yī)學(xué)和數(shù)據(jù)挖掘方法，篩選出了基于基本病機(jī)的抗PD中藥基礎(chǔ)方——龜芍平顫方（GPF）：龜甲、白芍、天麻、川芎，但其作用機(jī)制尚不明確。對(duì)于中藥多成分、多靶點(diǎn)的特性，生物信息學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為從分子網(wǎng)絡(luò)角度研究其作用機(jī)制提供了技術(shù)和理論上的支持[8-9]。生物信息學(xué)分析（IPA）平臺(tái)就是常用的一種功能強(qiáng)大的分析工具[10-11]。因此，課題組運(yùn)用IPA平臺(tái)分析預(yù)測(cè)GPF抗PD的分子機(jī)制，為進(jìn)一步完善PD治療方案提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 獲取GPF靶蛋白

檢索時(shí)限：1994年4月～2019年12月。數(shù)據(jù)庫：中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、維普期刊全文數(shù)據(jù)庫（VIP）、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（CBMdisc）、《中華本草》、PubMed、Web of Science、SciFinder Scholar。檢索龜甲、白芍、川芎、天麻的化合物，剔除重復(fù)者后，輸入到PubChem（http：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中確定對(duì)應(yīng)的人源活性靶蛋白。

1.2 獲取PD相關(guān)基因

以“Parkinson′s disease”為關(guān)鍵詞，在Gene（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數(shù)據(jù)庫中查找并記錄PD所有相關(guān)人源基因。

1.3 構(gòu)建GPF靶蛋白分子網(wǎng)絡(luò)和PD相關(guān)基因分子網(wǎng)絡(luò)

將已獲取的靶蛋白和基因信息上傳至IPA平臺(tái)，利用其網(wǎng)絡(luò)分析功能，分別構(gòu)建GPF靶蛋白分子網(wǎng)絡(luò)和PD相關(guān)基因分子網(wǎng)絡(luò)，并分析兩者主要涉及的疾病與生物功能。

1.4 分析GPF靶蛋白與PD相關(guān)基因共同作用的生物學(xué)通路

將GPF活性靶蛋白與PD相關(guān)基因上傳至IPA平臺(tái)，獲得主要生物學(xué)通路，并予以評(píng)分，且都有相應(yīng)的P值。基準(zhǔn)線代表-log（P-value），且P = 0.05。再運(yùn)用平臺(tái)的比較模塊，選取兩者共同作用的通路進(jìn)一步研究，并予圖表形式展示其可能的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 GPF活性靶蛋白的疾病與生物功能及分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

獲得GPF人類活性靶蛋白323個(gè)（龜甲58個(gè)、白芍119個(gè)、川芎72個(gè)、天麻74個(gè)），錄入其相應(yīng)的GI號(hào)，上傳至IPA平臺(tái)后，得到對(duì)應(yīng)的疾病與生物功能，主要集中在細(xì)胞凋亡與存活、機(jī)體損傷與異常等方面，圖1為前10位的疾病類型，表1為前5位的相關(guān)分子網(wǎng)及生物功能。GPF靶蛋白相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)共23個(gè)，運(yùn)用IPA構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

2.2 PD相關(guān)基因生物功能與分子網(wǎng)絡(luò)

獲得PD人源相關(guān)基因392個(gè)，對(duì)應(yīng)的分子網(wǎng)及生物功能主要集中在細(xì)胞凋亡與存活、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面，取排序前5位的進(jìn)行展示（表2）。PD相關(guān)基因的分子網(wǎng)絡(luò)共27個(gè)，運(yùn)用IPA構(gòu)建分子網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

2.3 GPF靶蛋白與PD相關(guān)基因共同作用的主要生物學(xué)通路

因每個(gè)靶蛋白及相關(guān)基因可能作用于不同的通路，而各通路之間又存在交集，故本研究只展示了IPA結(jié)果中排序前10的生物學(xué)通路，分屬于GPF靶蛋白（圖4）及PD相關(guān)基因（圖5）參與。

2.4兩者共同作用的生物學(xué)通路

以PD相關(guān)基因?yàn)榛鶞?zhǔn)，對(duì)比兩者共同作用且相關(guān)度最高的信號(hào)通路，可視化呈現(xiàn)前10條（圖6）。以此探尋GPF涉及的相關(guān)性最高的生物學(xué)通路，如圖6縱軸所示，信號(hào)通路為PD相關(guān)且相關(guān)度排序前10的信號(hào)通路，深色條柱為與PD的相關(guān)度，淺色條柱為共同信號(hào)通路中GPF的相關(guān)度。因本研究旨在探尋藥物的抗PD機(jī)制，故預(yù)測(cè)共同通路中GPF的相關(guān)度最高的G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）信號(hào)傳導(dǎo)可能是GPF抗PD的主要分子機(jī)制。

3 討論

PD屬于中醫(yī)“顫證”范疇，基本病機(jī)以肝腎不足、虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)為關(guān)鍵，風(fēng)貫穿始終，久病夾瘀[12-15]。GPF針對(duì)PD基本病機(jī)，其中龜甲補(bǔ)肝腎，養(yǎng)筋脈，定神志;白芍養(yǎng)陰緩急，平抑肝陽;天麻祛風(fēng)通絡(luò)，熄風(fēng)止痙;川芎既可活血祛風(fēng)，又能防止其他三藥的壅滯。四藥合用，既可補(bǔ)益肝腎、填精補(bǔ)髓、濡養(yǎng)筋脈以治本，又可平肝息風(fēng)、安神定志、活血通絡(luò)以治標(biāo)，可收到良好的防治PD之效。

藥理學(xué)研究也證實(shí)了GPF所含藥物的抗PD作用。龜甲提取物活性部位可減輕神經(jīng)損傷癥狀，在神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷后，可使神經(jīng)干細(xì)胞增殖，并向多種細(xì)胞系分化[16];有研究表明，龜甲提取物可能通過調(diào)控Otx2基因促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化[17]。芍藥苷對(duì)紋狀體及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元具有明顯保護(hù)作用，能夠明顯改善6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD大鼠神經(jīng)損傷[18]。天麻水煎液能顯著上調(diào)PD小鼠5-羥色胺受體、神經(jīng)肽Y受體、N-甲基-D-天門冬氨酸離子能谷氨酸受體2A和2B及多巴胺受體D3的表達(dá)[19]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，天麻素可以減慢多巴胺神經(jīng)元的代謝速度，進(jìn)而減少多巴胺的自身氧化，使多巴胺含量升高，并能保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[20]。川芎嗪可以減少PD大鼠的氧化應(yīng)激損傷，改善紋狀體細(xì)胞外液多巴胺代謝率，穩(wěn)定腦組織內(nèi)多巴胺濃度[21];同時(shí)川芎對(duì)PD小鼠也有神經(jīng)保護(hù)作用[22]。

基于IPA平臺(tái)的分析，預(yù)測(cè)GPCRs信號(hào)傳導(dǎo)通路為GPF抗PD最可能的生物通路。GPCRs是一個(gè)超級(jí)膜蛋白家族，參與生物體內(nèi)大部分的信號(hào)調(diào)節(jié)和生理活動(dòng)，其下游有多種信號(hào)通路，以環(huán)腺苷酸和磷脂酰肌醇為主要通路。多巴胺受體（DR）屬于GPCRs，DR家族共有5個(gè)成員，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以D1R和D2R分布最為廣泛。D1R和D2R可以通過G蛋白依賴的方式，通過cAMP/PKA信號(hào)通路、磷酯酶C信號(hào)通路和G蛋白門控內(nèi)向整流鉀離子通道信號(hào)通路介導(dǎo)腦內(nèi)多巴胺能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等神經(jīng)功能，并參與PD等神經(jīng)退行性病的發(fā)生、發(fā)展[23]。GPCRs和PI3K/AKT信號(hào)通路通過鳥苷三磷酸酶產(chǎn)生聯(lián)系，并可保護(hù)殘存的多巴胺能神經(jīng)元[24]。近來研究表明，小鼠GPCR6缺乏會(huì)顯著影響黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)，同時(shí)在紋狀體多巴胺耗竭后產(chǎn)生激動(dòng)劑激活DR[25]。GPF可能正是通過GPCRs等生物學(xué)通路發(fā)揮抗PD效應(yīng)，但尚需進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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（收稿日期：2020-02-10 ?本文編輯：李亞聰）