他唑巴坦合成中環(huán)合反應(yīng)中間體的異構(gòu)體分離與二維核磁解析

陳斌 張小金 郭靖寧 劉英 張祥明 謝永居

摘 要 他唑巴坦是日本大鵬藥業(yè)公司開發(fā)的一種重要的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。利用柱層析對其合成中環(huán)合反應(yīng)的六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行分離，并用核磁氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR、二維核磁相關(guān)譜1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及DEPT135對分離的六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)歸屬解析。

關(guān)鍵詞 他唑巴坦中間體 異構(gòu)體 分離 核磁共振二維譜解析

中圖分類號：O657.61 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）13-0073-04

Isolation and 2D-NMR analysis of intermediate isomer in the synthesis of tazobactam

CHEN Bin*， ZHANG Xiaojin， GUO Jingning， LIU Ying， ZHANG Xiangming， XIE Yongju**（Jiangxi Fushine Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jiangxi Jingdezhen 333000， China）

ABSTRACT Tazobactam is an important β-lactamase inhibitor developed by Japan Taiho pharmaceutical company. The impurity of six-membered ring isomer in the cyclization reaction of tazobactam synthesis was isolated by column chromatography and analyzed by 1H-NMR， 13C-NMR， 1H-1HCOSY， HSQC， HMBC and DEPT135.

KEy WORDS tazobactam intermediate； isomer； isolation； 2D-NMR analysis

他唑巴坦為β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，由日本大鵬制藥公司開發(fā)并于1992年上市，常與哌拉西林或頭孢哌酮合用，與哌拉西林鈉聯(lián)合使用時，產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，廣泛用于治療嚴(yán)重全身性和局部感染、腹腔感染、下呼吸道感染、軟組織感染、敗血癥等，比已使用的其它抗菌復(fù)合劑具有更廣泛的抗菌譜及適應(yīng)證，在克服耐藥性方面顯示出巨大優(yōu)勢[1-3]。他唑巴坦有很多合成路線[4-8]，目前大部分的工業(yè)合成路線是以Tazo-A為起始原料，經(jīng)開環(huán)形成二硫化物Tazo-B， 再經(jīng)環(huán)化反應(yīng)形成中間體 Tazo-C（圖1），同時會形成六元環(huán)異構(gòu)體[9-10]。對此六元環(huán)異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)確證對于產(chǎn)品質(zhì)量方面的控制具有重要的意義。截止目前，未見該化合物的核磁結(jié)構(gòu)解析文獻(xiàn)報道。本文利用柱層析對合成Tazo-C的環(huán)合反應(yīng)產(chǎn)生的六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行分離，并用核磁氫譜1H-NMR、碳譜13C-NMR、二維核磁相關(guān)譜1H-1HCOSY、HSQC、HMBC以及DEPT135對分離的六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行了歸屬解析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

400 MHz NMR核磁共振儀（Bruker公司）；UTP-313電子天平（上海花潮電器有限公司）；Xevo G2-XS Tof質(zhì)譜儀、E2695液相色譜（Waters公司）。

1.2 試劑

化合物Tazo-A（99%，江西富祥藥業(yè)股份有限公司）；2-巰基苯丙噻唑、亞硝酸鈉、碳酸氫鈉（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲苯、鹽酸、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷（均為分析純）和 粒徑50～74 mm 硅膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 實驗方法

1H-NMR、13C-NMR、DEPT 135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC均在Bruker公司400 MHz核磁共振波譜儀上測定。1H-NMR的觀測頻率為400 MHz，13C-NMR的觀測頻率為100 MHz。核磁共振實驗采用5 mm直徑核磁管，一維、二維核磁實驗均在控溫下進(jìn)行。

2 六元環(huán)異構(gòu)體的分離

參考文獻(xiàn)合成Tazo-C[11]，反應(yīng)料液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得約40 g Tazo-C，加乙酸乙酯30～40 ml溶解，搖勻，加硅膠60～80 g，攪拌均勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，使呈粉末態(tài)，備用。

取玻璃柱（直徑8.5 cm，柱長80 cm），加入硅膠至約3/5柱體積。加入洗脫液，（正己烷-乙酸乙酯20∶1），至柱子中硅膠呈均一狀。然后，緩慢加入上述粉末，加入洗脫液開始過柱，常壓過柱，收集洗脫液，在過柱約8～9 L時，目標(biāo)產(chǎn)物開始出現(xiàn)，收集過柱液，液相檢測。收集含有六元環(huán)異構(gòu)體料液，自然蒸發(fā)，析晶可得純度較好的固體0.5 g。經(jīng)HPLC檢測其純度為100%（圖2，左為六元環(huán)異構(gòu)體特征峰，右為他唑巴坦特征峰）；質(zhì)譜檢測其分子量為401（[M+Na]+以及[2M+Na]+）（圖3）。

3 六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)的核磁共振解析

1H-NMR譜（圖4）中顯示分子中共有多組質(zhì)子信號，共20個質(zhì)子。δ 7.26的質(zhì)子為溶劑質(zhì)子信號。13C-NMR（圖5）示出樣品分子有多組C信號，分子中共含21個碳。DEPT135譜圖（圖6）顯示有2組仲碳、9組叔碳或伯碳，其余為季碳。依據(jù)HSQC譜圖（圖7）可以確認(rèn)各組碳與氫的連接關(guān)系。1H-NMR譜圖中，δ 1.50（s， 3H）為單峰，且為3個質(zhì)子，根據(jù)甲基的出峰規(guī)律，歸屬為H26， 對應(yīng)的HSQC譜圖（圖7）中δ 28.97歸屬為C26。

根據(jù)DEPT135譜圖，可知δ 62.23為季碳，因此可歸屬為C19。

1H-NMR譜圖中，δ 7.35為10個質(zhì)子，根據(jù)芳香族質(zhì)子的出峰規(guī)律，可以歸屬為H1/H2/H3/H4/ H6和H7/H9/H10/ H11/H12，HSQC中對應(yīng)的碳為δ 126.89，δ 127.50，δ 128.46，δ 128.66，δ 128.78，δ 138.65和138.70。

1H-NMR譜圖中，δ H 6.89為單峰，且為1個質(zhì)子，結(jié)合HSQC以及DEPT135， 所對應(yīng)的δ 79.06為叔碳，HMBC（圖8）中，δ 6.89與芳環(huán)碳有相關(guān)，因此δ 6.89（s， 1H）歸屬為H13， δ 79.06歸屬為C13。

結(jié)合13C-NMR以及DEPT135， δ 164.53和δ 166.28為季碳，又根據(jù)HMBC圖，δ 166.28與H13有相關(guān)，因此，δ 166.28歸屬為C15，δ 164.53歸屬為C24。

結(jié)合HSQC以及1H-NMR譜，質(zhì)子δ 2.62（d， 2H， J=16 Hz）與質(zhì)子δ 3.61（d， 2H， J =16 Hz）為同碳質(zhì)子，且為仲碳質(zhì)子；質(zhì)子δ 2.99（d， 2H， J=16 Hz）與質(zhì)子δ3.36（d， 2H， J=16 Hz）為同碳質(zhì)子，且為仲碳質(zhì)子。又根據(jù)HMBC圖，C24與質(zhì)子δ 2.99（d， 2H， J=16Hz）與質(zhì)子δ 3.36（d， 2H， J=16 Hz）有相關(guān)，因此，質(zhì)子δ 2.99（d， 2H， J=16 Hz）與質(zhì)子δ 3.36（d， 2H， J =16 Hz）歸屬為H23，HSQC中對應(yīng)的δ 45.85為C23； 質(zhì)子δ 2.62（d， 2H， J =16 Hz）與質(zhì)子δ 3.61（d， 2H， J=16 Hz）歸屬為H18， HSQC中對應(yīng)的δ 37.46為C18。

1H-1HCOSY圖（圖9）中，H23與δ 4.97有相關(guān)，因此δ 4.97歸屬為H21， HSQC中對應(yīng)的δ 46.49為C21。

根據(jù)HMBC圖，C15與δ 4.85有相關(guān)，且對應(yīng)的DEPT135中δ 61.19為叔碳，因此δ 4.85歸屬為H17， δ61.19歸屬為C17。

由上述分析知，δ 126.89，δ 127.50，δ 128.46，δ128.66，δ 128.78，δ 138.65和138.70為芳香族碳，根據(jù)HSQC， δ 138.65和138.70為季碳，因此δ 138.65和138.70歸屬為C5/C8。HMBC圖中，δ 126.89，δ 127.50與H13相關(guān)，因此δ 126.89，δ 127.50歸屬為C7/C9和C4/C6。根據(jù)苯環(huán)的對稱以及豐度規(guī)律，δ 128.46和δ128.66歸屬為C2/C11， 豐度最高的δ 128.78歸屬為C1/ C3/C10/C12。至此，六元環(huán)異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)見圖1、氫譜和碳譜歸屬結(jié)果見表1和表2。

4 討論

本文采用柱層析制備分離了他唑巴坦中間體六元環(huán)異構(gòu)體并用一維核磁和二維核磁1H-NMR、13C-NMR、DEPT135、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC技術(shù)解析了六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了對此雜質(zhì)的氫譜和碳譜的全歸屬，后續(xù)可以對此雜質(zhì)的衍生化反應(yīng)以及反應(yīng)過程中出現(xiàn)的Tazo-C產(chǎn)品和六元環(huán)異構(gòu)體雜質(zhì)比例等方面進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 張建民， 鐘超平. 泰唑巴坦合成路線圖解[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 1995， 26（9）： 428-429.

[2] Arakawa S， Kawahara K， Kawahara M， et al. The efficacy and safety of tazobactam/ceftolozane in Japanese patients with uncomplicated pyelonephritis and complicated urinary tract infection[J]. J Infect Chemother， 2019， 25（2）： 104-110.

[3] Pilmis B， Petitjean G， Lesprit P， et al. Continuous infusion of ceftolozane/tazobactam is associated with a higher probability of target attainment in patients infected with Pseudomonas aeruginosa[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2019， 38（8）： 1457-1461.

[4] 郝東亮， 李保勇， 張志騰. 一種他唑巴坦的制備方法：CN201910094506.6[P]. 2019-01-30.

[5] 李保勇， 郝春波， 宿乾貞， 等. 一種他唑巴坦的制備方法：CN201910089679.9[P]. 2019-01-30.

[6] Hao Hu， Aya Ohno， Takuma Sato， et al. Self-assembled polymeric pyridine copper catalysts for huisgen cycloaddition with alkynes and acetylene gas： application in synthesis of tazobactam[J]. Org Process Res Dev， 2019， 23（4）： 493-498.

[7] Xu WL，Li YZ，Zhang QS， et al. A new approach to the synthesis of tazobactam using an organosilver compound[J]. Synthesis， 2005（3）： 442-446.

[8] 李寶才， 潘光榮， 周強(qiáng). 一種他唑巴坦酸的合成方法：CN201710308857.3[P]. 2017-05-04.

[9] Kamiya T， Teraji T， Saito Y， et al. Studies on β-lactam antibiotics. I. A novel conversion of penicillins into cephalosporins[J]. Tetrahedron Lett， 1973， 14（32）： 3001-3004.

[10] Tanaka H， Tanaka M， Yamada S， et al. A facile halogenative cyclization of 4-（2-benzothiazolyldithio）azetidinones（Kamiyas disulfide） into 2β-（halomethyl）penams in a two layer system[J]. Bull Chem Soc Jpn， 1989， 62（9）： 3046-3048.

[11] Micetich RG， Maiti， SN， Spevak P， et al. Synthesis of 2b-azidomethylpenicillin-1，1-dioxides and 3β-azido-3α-methylcepham-1，1-dioxides[J]. Synthesis， 1986（4）： 292-296.