人臍帶間充質(zhì)干細胞大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射安全性研究

崔曉燕

摘 要 目的：觀察人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells， hUC-MSCs）膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射對大鼠的毒性反應(yīng)。方法：實驗分為生理鹽水對照組、有血清MSCs低劑量組和高劑量組、無血清MSCs低劑量組和高劑量組。觀察大鼠一般生命體征和血液尿液指標；取主要臟器組織進行病理學(xué)檢查。結(jié)果：注射MSCs后，MSCs組與生理鹽水對照組相比，大鼠一般生命體征、血常規(guī)、T淋巴細胞亞群、血清細胞因子、尿常規(guī)，均無顯著差異；主要臟器組織病理學(xué)無明顯改變。一部分血液生化指標雖然在MSCs注射后有所波動，但仍在參考范圍內(nèi)或接近參考范圍上限。結(jié)論：膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射hUC-MSCs對大鼠沒有明顯的毒性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 人臍帶間充質(zhì)干細胞 大鼠 膝關(guān)節(jié)注射

中圖分類號：R965.3； Q813.11 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）13-0063-07

Safety study of intra-articular administration of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in rats

CUI Xiaoyan*

（Shanghai Baonian biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201615， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the toxic reactions of intra-articular administration of human umbilical cordderived mesenchymal stem cells （hUC-MSCs） in rats. Methods： Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into a normal saline control group， a low-dose F-MSCs （MSCs cultured with fetal bovine serum） group， a high-dose F-MSCs group， a low-dose SF-MSCs （MSCs cultured with serum-free medium） group， and a high-dose SF-MSCs group. General vital signs， blood routine， blood biochemistry， subsets of T cells， serum cytokines， routine urine， pathology of vital organs and tissues were respectively determined. Results： There were no obvious differences between the MSCs group and the control group in all other indicators except some blood biochemistry indicators. Conclusion： There was no obvious toxic effect of intra-articular administration of hUC-MSCs on rats.

KEy WORDS human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells； rat； intra-articular administration

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一類源自中胚層，可在體外誘導(dǎo)分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞等的多能干細胞[1]。人臍帶來源MSCs（human umbilical cord-derived MSCs，hUC-MSCs）由于取材方便和增殖快等優(yōu)點，越來越受到臨床應(yīng)用的重視[2]。目前ClinicalTrials.gov官網(wǎng)注冊的hUC-MSCs治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床試驗研究中，大多數(shù)試驗處于Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究階段；且已發(fā)表的MSCs治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床研究報道中[3-5]，大多數(shù)研究為Ⅰ/Ⅱ期安全性和有效性研究。因此，hUC-MSCs用于治療膝關(guān)節(jié)疾病的安全性仍有待于探索。國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出“細胞培養(yǎng)過程中，應(yīng)盡量避免使用動物或人來源的物質(zhì)，比如應(yīng)盡量避免血清的使用”，因此本研究中hUC-MSCs的培養(yǎng)，除原有有血清培養(yǎng)體系之外，又使用含血清替代物的無血清培養(yǎng)體系。我們將2種培養(yǎng)體系的hUC-MSCs通過膝關(guān)節(jié)注射到正常Sprague-Dawley （SD）大鼠，動態(tài)監(jiān)測大鼠一般生命體征、血常規(guī)、血液生化指標、T淋巴細胞亞群、血清細胞因子、尿常規(guī)等指標的變化，主要臟器組織進行病理學(xué)檢查。闡明膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射hUC-MSCs 對SD大鼠的毒性反應(yīng)，從而為hUC-MSCs的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 人臍帶來源間充質(zhì)干細胞

hUC-MSCs采用組織貼塊法培養(yǎng)，分為兩種不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)：①含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone）的有血清培養(yǎng)體系，MSCs標記為F-MSCs；②含5%的血清替代物（Helios）的α-MEM培養(yǎng)基（Gibco）的無血清培養(yǎng)體系，MSCs標記為SF-MSCs。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠共80只，6周齡，雌雄各50%，購自上海西普爾-必凱動物有限公司，合格證號20130016011010。

1.3 方法

1.3.1 hUC-MSCs細胞形態(tài)和表型鑒定

采用流式儀（FACSCanto II，美國BD公司）檢測細胞表型，流式抗體PE Anti-Human CD44、CD90、CD73、CD105，CD14、CD19、CD34、CD45和PerCP Anti-Human HLA-DR均購自美國BD公司。

1.3.2 hUC-MSCs分化潛能分析

成脂試劑盒和成軟骨試劑盒（中國Cyagen公司）及成骨試劑盒（美國Gibco公司），分別用于鑒定第5代hUC-MSCs向脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞分化潛能。

1.3.3 動物實驗

SD大鼠分為5組：生理鹽水對照組、有血清MSCs低劑量組、有血清MSCs高劑量組、無血清MSCs低劑量組和無血清MSCs高劑量組。每組各16只，雌雄各50%。

MSCs組分別于第0和21天時膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.4 ml第5代hUC-MSCs，左右后肢關(guān)節(jié)腔各注射0.2 ml。低劑量組注射（1×106）/kg的hUC-MSCs，高劑量組注射（1×107）/kg的hUC-MSCs，生理鹽水組于第0和21天時膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射0.4 ml生理鹽水。

1.3.4 安全性評價

1）檢測一般生命體征 首次MSCs注射前（D0）、首次MSCs注射后的第14（D14）和35天（D35），觀察和記錄一般生命體征，包括肛溫、血壓、心率及注射部位局部觀察，用nt X檢測肛溫，Softron 2006A檢測血壓和心率。稱量體重。

2）移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）評分 在D0、D14、D35分別對動物進行GVHD評分，5個參數(shù)，各參數(shù)總分2分。①體重：每周體重下降<10%記為0分；下降10%～25%記為1分；下降>25%記為2分。②活動度：無下降記為0分；輕度下降記為1分；重度下降記為2分。③皮膚潰瘍：皮膚完整無脫毛記為0分；小片淺潰瘍或脫毛脫毛記為1分；大片潰瘍明顯皮膚裸露記為2分。④姿勢：無異常記為0分；輕度異常記為1分；姿勢呈弓背樣改變記為2分。⑤聳毛：無聳毛記為0分；輕度聳毛記為1分；重度聳毛記為2分。

3）血常規(guī)和生化指標檢測 在D0、D14、D35分別于眼眶靜脈叢采血，EDTA抗凝，檢測和比較血常規(guī)；采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測生化指標。

4）T淋巴細胞亞群免疫學(xué)指標 在D0、D14、D35分別于眼眶靜脈叢采血，EDTA抗凝，分離單核細胞，使用CD3抗體（FITC Mouse Anti-Rat CD3，美國BD公司），CD4抗體（PE-Cy 5 Mouse Anti-Rat CD4）和CD8抗體（PE Mouse Anti-Rat CD8a）均購自美國eBioscience公司，4 ℃避光孵育1 h，用Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）檢測T淋巴細胞亞群。

5）血清細胞因子檢測 采用BD公司的CBA試劑盒檢測血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-10、TNF含量。

6）尿常規(guī)檢測 在D0、D14、D35分別采集大鼠尿液，檢測和比較尿常規(guī)。

7）病理學(xué)檢查 在D14、D35分別處死并解剖8只大鼠/組，取心、肝、脾、肺、腎、腦和注射部位肌肉，甲醛固定，石蠟包埋，采用徠卡公司SQ2125石蠟切片機切片，HE染色。采用Nikon Eclipse Ni顯微鏡觀察組織病理學(xué)有無改變。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSCs的鑒定

hUC-MSCs細胞形態(tài)均為梭形。

流式細胞儀檢測第3代SF-MSCs特異性表面抗原CD44、CD90、CD73和CD105的陽性率分別為99.9%、100.0%、99.4%、98.1%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表達為陰性。第3代F-MSCs特異性表面抗原CD44、CD90、CD73、和CD105的陽性率分別為100.0%、100.0%、99.5%、99.0%，而CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR的表達為陰性。

第3代F-MSCs和SF-MSCs在成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)條件下，形成大的脂滴、軟骨球和鈣結(jié)節(jié)。

2.2 一般生命體征

大鼠注射生理鹽水和MSCs后全部存活。注射MSCs各組和注射生理鹽水組相比，體重、肛溫、收縮壓、舒張壓和心率全部無顯著性差別（表1）。

2.3 GVHD評分

MSCs組和生理鹽水對照組，GVHD評分均為0分。

2.4 血常規(guī)

注射MSCs后，血常規(guī)指標無顯著改變（P > 0.05，表2）。

2.5 血液生化

D14測定的血液生化指標與生理鹽水組相比，有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALP（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）顯著升高，有血清低劑量組、有血清高劑量組、無血清低劑量組和無血清高劑量組的ALB（白蛋白）和BUN（尿素氮）顯著升高，無血清高劑量組的TC（總膽固醇）顯著升高，有血清低劑量組、有血清高劑量組、無血清低劑量組和無血清高劑量組的GLU（葡糖糖）顯著升高，其他血液生化指標無顯著改變（P > 0.05，表3）。

與生理鹽水組相比，D35有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALT顯著升高，有血清低劑量組、有血清高劑量組、無血清低劑量組和無血清高劑量組的AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、ALB和BUN顯著升高，有血清高劑量組的TC顯著升高，其他血液生化指標無顯著改變（P > 0.05，表3）。

2.6 T淋巴細胞亞群指標

與生理鹽水對照組相比，MSCs注射組CD3+、 CD4+、CD8+ T淋巴細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+比值無顯著改變（圖1）。

2.7 血清細胞因子檢測

血清IFN-γ和IL-2均未檢測到，與生理鹽水對照組相比較，MSCs組注射MSCs后TNF（腫瘤壞死因子）、IL-4、IL-10含量無顯著改變（圖2）。

2.8 尿常規(guī)

與生理鹽水對照組相比較，MSCs注射組尿常規(guī)指標無顯著改變（P > 0.05）。

2.9 病理學(xué)檢測

病理學(xué)評價委托中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物安全評價研究中心完成。經(jīng)顯微鏡下診斷，有血清MSCs低劑量組、高劑量組和無血清MSCs低劑量組、高劑量組的7種組織臟器（心、肝、脾、肺、腎、腦、骨骼肌）均未見明顯與MSCs相關(guān)的病理組織學(xué)改變。3 討論

近年來MSCs干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床前研究和臨床研究日益增多[6-10]，臍帶由于取材方便和易于擴增等優(yōu)點成為膝骨關(guān)節(jié)炎細胞治療的重要原材料。本實驗中2種培養(yǎng)體系的人臍帶間充質(zhì)干細胞的表面抗原表型和分化潛能均符合國際細胞治療協(xié)會（International Society for Cellular Therapy， ISCT）制定的MSCs鑒定標準[11]，hUC-MSCs細胞純度在95 %以上。

GVHD是異基因造血干細胞移植引起的一種危及生命的并發(fā)癥[12]。本實驗GVHD評分為0分，注射hUCMSCs沒有引發(fā)大鼠GVHD。hUC-MSCs表達HLA-G，HLA-G具有很強的免疫抑制作用[13]。同時hUC-MSCs不表達HLA-II抗原，為低免疫原性細胞。

有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALP、無血清MSCs高劑量組的TC、各實驗組的GLU，雖然在D14顯著升高，但在D35與生理鹽水對照組相比無顯著差異。

各實驗組的ALB（D14和D35）、有血清低劑量組和有血清高劑量組的ALT（D35）、各實驗組的AST（D35），雖然這三個生化指標在MSCs注射后有所升高，但是仍然在參考范圍內(nèi)：SD雄性大鼠ALB為3.9～4.9 g/dl，雌性大鼠ALB為4.0～5.2 g/dl；SD雄性大鼠ALT為25～55 IU/L，雌性大鼠ALT為25～50 IU/L；SD雄性大鼠AST為60～300 IU/L，雌性大鼠AST為80～250

IU/L[14]。

各實驗組的BUN，雖然在MSCs注射后，與同時間點的生理鹽水對照組相比升高，但是與MSCs注射前相比，自身變化不大。即MSCs低劑量組和高劑量組大鼠，在MSCs注射前后BUN無顯著性改變。有血清MSCs高劑量組的TC在D35與生理鹽水對照組 相比有顯著性升高，鑒于接近參考值（2.59 mmol/L）[14]，且屬于個別異常，因此考慮與MSCs注射無關(guān)。

根據(jù)臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)分析的通用指導(dǎo)原則，臨床病理學(xué)參數(shù)不能孤立地進行評價，當(dāng)只有血液生化指標活性或濃度大于正常水平上限的2倍時， 說明臟器組織受到損傷[15]。上述血液生化指標雖然在MSCs注射后有所波動，但鑒于仍在參考范圍內(nèi)或接近參考范圍上限，并且組織病理學(xué)未見明顯與hUC-MSCs相關(guān)的病理組織學(xué)改變，因此說明hUC-MSCs對大鼠的物質(zhì)代謝、肝、腎功能沒有造成損害。

通過尾靜脈移植的MSCs往往分布于肺、脾、腎、皮膚等含血量多的器官中[16]。本研究hUC-MSCs通過膝關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射，沒有設(shè)計hUC-MSCs的定植和分化實驗，已在正開展的研究中增加了該項實驗。

總之，本研究表明膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射有血清培養(yǎng)體系和無血清培養(yǎng)體系的2種hUC-MSCs，沒有引起大鼠一般生命體征、GVHD評分、血常規(guī)、T淋巴細胞亞群、血清細胞因子、尿常規(guī)和組織病理學(xué)明顯改變，對實驗大鼠無明顯毒性作用。本研究為hUC-MSCs的膝關(guān)節(jié)臨床應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

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