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    H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗安全性試驗(yàn)研究

    2011-08-08 06:37:40劉芳萍羅鵬志李昌文王牟平智海東劉景利佟恒敏劉艷艷盧斯亮陳雪英
    關(guān)鍵詞:眼結(jié)膜刺激性佐劑

    劉芳萍,羅鵬志,李昌文,王牟平,智海東,劉景利,佟恒敏,劉艷艷,盧斯亮,陳雪英

    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,哈爾濱 150001)

    禽流感 (Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一種禽類急性傳染病。根據(jù)AIV對(duì)易感雞致病性的差異,可將AIV分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。近年來(lái),高致病性H5N1亞型禽流感在世界上許多國(guó)家暴發(fā)流行,給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí),由于禽流感病毒具有感染人的能力,也給人類的身體健康造成巨大的威脅[1]。目前,臨床上對(duì)禽流感的防控主要是采用禽流感油佐劑滅活疫苗,以預(yù)防為主。

    當(dāng)今疫苗的安全性,特別是重大動(dòng)物疫病疫苗的安全性已成為人們關(guān)注焦點(diǎn)[2]。油佐劑滅活疫苗以其安全、免疫效力高、免疫持續(xù)期長(zhǎng)等特點(diǎn),已成為預(yù)防動(dòng)物傳染病不可缺少的免疫制劑,其安全性問題同樣不容忽視[3-4]。以往在評(píng)價(jià)疫苗的安全性試驗(yàn)中,一般以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否發(fā)病作為疫苗是否安全的標(biāo)準(zhǔn),這種評(píng)價(jià)方法帶有一定的局限性[5]。為了評(píng)價(jià)H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗使用的安全性,本文對(duì)其急性毒性、眼結(jié)膜刺激性、肌肉刺激性及溶血性進(jìn)行試驗(yàn)研究,從而為臨床安全、合理使用疫苗提供試驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    大耳白兔,雄性,1.8~2.3 kg,購(gòu)自哈爾濱漢方實(shí)驗(yàn)鼠類養(yǎng)殖所。

    AA+肉雞,雌雄各半,購(gòu)自哈爾濱振明養(yǎng)殖場(chǎng)。

    1.2 試驗(yàn)藥品

    H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗,由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供;H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗佐劑,由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

    1.3 急性毒性試驗(yàn)

    取7日齡AA+肉雞70只,隨機(jī)分成7組,每組10只,雌雄各半,1~6組為試驗(yàn)組(分別為高劑量疫苗組與佐劑組、中劑量疫苗組與佐劑組、低劑量疫苗組與佐劑組),第7組為空白對(duì)照組。試驗(yàn)前禁食14 h,不禁水,以雞能承受的最大給藥濃度和最大給藥容積,采取頸背部皮下給藥。具體給藥劑量見表1。

    表1 急性毒性試驗(yàn)給藥劑量Table 1 Dose of acute toxicity experiment

    常規(guī)飼養(yǎng)14 d,觀察雞的精神狀態(tài)、中毒時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、恢復(fù)狀況。每組隨機(jī)取2只雞斷頭處死,觀察體腔積液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胃腸等的變化。由于給藥體積非常大,已超出雞正常生理代償能力時(shí),雞仍未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡,無(wú)法測(cè)得該疫苗的半數(shù)致死量LD50,故而進(jìn)行最大給藥量測(cè)定試驗(yàn)。

    取7日齡AA+肉雞30只,雌雄各半。試驗(yàn)前禁食14 h,不禁水,采取頸背部皮下給藥,以最大給藥濃度和雞能承受的最大給藥容積,于1 d內(nèi)間隔6 h兩次注射疫苗和佐劑。給藥后常規(guī)飼養(yǎng)7 d,逐日觀察雞的外觀、精神狀態(tài)、飲食、睡眠、活動(dòng)狀況及死亡數(shù)。

    1.4 眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)

    取健康兔12只,采用自身對(duì)照法,分為兩組,每組6只。第一組,每只兔左眼滴加疫苗2滴,右眼滴加生理鹽水2滴。第二組,每只兔左眼滴加佐劑2滴,右眼滴加生理鹽水2滴,觀察兔眼的情況。給藥后,使兔眼被動(dòng)閉合5~10 s,讓藥液和眼充分接觸,2 min后立即用生理鹽水沖洗眼睛至眼中無(wú)任何異物,隨后觀察兔眼的情況1.5~3 h。進(jìn)行受試物對(duì)眼刺激性評(píng)分,并計(jì)算積分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為無(wú)刺激性(0~3分)、輕度刺激性(4~8分)、中度刺激性(9~12 分)和強(qiáng)刺激性(13~16 分)4 個(gè)等級(jí)[6]。

    1.5 肌肉刺激試驗(yàn)

    取健康兔8只,采用自身對(duì)照,分為兩組,每組4只。第一組左側(cè)股四頭肌注射疫苗1 mL,右側(cè)注射生理鹽1 mL。第二組,左側(cè)股四頭肌注射佐劑1 mL,右側(cè)注射生理鹽1 mL。注射后正常飼養(yǎng),48 h后將兔處死,解剖取出股四頭肌,縱向切開,觀察注射部位肌肉組織有無(wú)刺激現(xiàn)象(充血、水腫、硬結(jié)、變性或壞死)。進(jìn)行受試物對(duì)肌肉刺激性評(píng)分。結(jié)果判斷:平均反應(yīng)分值在2級(jí)及以下者,可認(rèn)為符合規(guī)定;大于2級(jí)者則認(rèn)為不符合規(guī)定,不供肌肉注射或靜脈注射[7]。

    1.6 溶血試驗(yàn)

    取健康兔1只,自心臟采血5 mL,用生理鹽水稀釋成2%的混懸液。按表2加入2%的紅細(xì)胞混懸液、生理鹽水、蒸餾水和疫苗,混勻后,置37℃恒溫箱中。開始每隔30 min觀察1次,2次后,每隔1 h觀察1次,觀察4 h。結(jié)果判斷:陰性對(duì)照管無(wú)溶血和凝聚發(fā)生,陽(yáng)性對(duì)照管發(fā)生溶血。若供試品管中的溶液在3 h內(nèi)不發(fā)生溶血和凝聚,供試品則可用于注射;若供試品管中的溶液在3 h內(nèi)發(fā)生溶血和(或)凝聚,則供試品不宜用于注射[8]。

    表2 溶血試驗(yàn)反應(yīng)Table 2 Reaction of hemolysis test (mL)

    2 結(jié)果與分析

    2.1 急性毒性試驗(yàn)

    給藥后14 d內(nèi),各給藥劑量組雞除第一天給藥后有點(diǎn)不適,活動(dòng)減少外,未見發(fā)生中毒癥狀和死亡。每組隨機(jī)取2只雞,斷頭處死后病理學(xué)剖檢,肉眼觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胃腸等主要臟器,未出現(xiàn)眼觀病理變化。由于給藥容積已超出雞正常生理代償能力,雞仍未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡,所以不能精確計(jì)算該疫苗的LD50,故進(jìn)行最大給藥量測(cè)定試驗(yàn)。

    一日內(nèi)最大給藥量的測(cè)定試驗(yàn)中,第一次注射完20倍臨床劑量的疫苗或佐劑后,進(jìn)行第二次注射時(shí),藥物已無(wú)法繼續(xù)進(jìn)入體內(nèi),限于給藥農(nóng)度和給藥容積,因此,確定H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗最大給藥量為其臨床使用劑量的20倍。

    2.2 眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)

    眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可見,疫苗組和佐劑組試驗(yàn)兔眼,均出現(xiàn)虹膜輕度充血、腫脹,瞳孔仍對(duì)光有反應(yīng),結(jié)膜充血,呈鮮紅色,眼瞼伴有輕微水腫。兩生理鹽水對(duì)照組兔眼均無(wú)異常反應(yīng)。表明疫苗對(duì)眼睛有輕度的刺激性,且該刺激性主要源于佐劑。

    表3 眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of eye irritation test

    2.3 肌肉刺激性試驗(yàn)

    結(jié)果見圖1。

    圖1 注射藥物后肌肉解剖Fig.1 Muscle anatomy after drug injection

    經(jīng)肌肉注射給藥后,兩組兔健康,腿部活動(dòng)正常。剖檢可見,兩組試驗(yàn)兔左腿和右腿在注射部位均未出現(xiàn)肌肉變性或壞死,僅在左腿針眼處均有相同程度的輕微充血,在注射部位附近肌肉上殘留有少量白色干酪物,如圖1所示。各組反應(yīng)級(jí)別之和均為2。結(jié)果表明,該疫苗的佐劑吸收性相對(duì)較差,在注射部位還殘留有少量的干酪物,引起給藥部位輕度充血。

    2.4 溶血試驗(yàn)

    結(jié)果見表4??芍?,7號(hào)試管(陽(yáng)性對(duì)照管)在0.5 h內(nèi)就發(fā)生完全溶血,溶液澄明紅色,管底無(wú)細(xì)胞殘留;其余6管上清液無(wú)色澄明,紅細(xì)胞全部下沉,在4 h內(nèi)均未出現(xiàn)溶血和凝集反應(yīng)。結(jié)果表明,該疫苗無(wú)溶血性,符合注射劑的要求。

    表4 溶血性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of hemolysis test

    3 討論與結(jié)論

    疫苗接種的不良反應(yīng)越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注,因?yàn)橐呙缃臃N也會(huì)發(fā)生除正常免疫反應(yīng)以外的不利于機(jī)體的不良反應(yīng),因此在研究疫苗效果的同時(shí),對(duì)其安全性的評(píng)估也不容忽視。H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗以油包水的形式存在,疫苗經(jīng)機(jī)體降解與吸收后逐漸緩慢釋放抗原,起到了抗原庫(kù)的作用,刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體水平較高,持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),一次接種可獲得較好的免疫力等優(yōu)點(diǎn)。但是,油佐劑疫苗的制造過程中可能由于抗原的制造,或疫苗佐劑的原因,使得制造的油佐劑疫苗對(duì)動(dòng)物免疫時(shí)會(huì)造成局部或全身的臨床反應(yīng),如局部組織發(fā)炎和腫脹,甚至造成動(dòng)物的死亡,因此,一種合格的疫苗不僅要求效力檢驗(yàn)符合要求,首先還必須安全[9-10]。

    為了評(píng)價(jià)H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗的安全性,本研究針對(duì)疫苗及其佐劑,直接選擇靶動(dòng)物-雞進(jìn)行急性毒性試驗(yàn);并同時(shí)進(jìn)行了兔眼結(jié)膜刺激性試驗(yàn)、肌肉刺激性試驗(yàn)及溶血性試驗(yàn)。

    急性毒性試驗(yàn)中,因給藥濃度和給藥容積已至最大,仍未出現(xiàn)雞死亡,未能測(cè)出其LD50,按照毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),可不必測(cè)定LD50,故而進(jìn)行一日內(nèi)最大給藥量測(cè)定試驗(yàn),測(cè)得20倍臨床劑量為其最大給藥量,說(shuō)明該疫苗臨床使用劑量是安全的。在試驗(yàn)過程中,高劑量疫苗組及佐劑組肉雞出現(xiàn)精神沉郁,且兩組之間無(wú)明顯差別,因此主要與給予雞大體積的藥物后,且是頸背部皮下給藥,大體積的藥物對(duì)嗉囊的壓迫,使肉雞攝食減少,同時(shí)大體積多次注射對(duì)試驗(yàn)雞還存在一定的機(jī)械性損傷。

    眼結(jié)膜刺激試驗(yàn)中,疫苗組和佐劑組兔眼均有相似的虹膜輕度充血、腫脹,結(jié)膜充血,眼瞼伴有輕微水腫。按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分,試驗(yàn)兔眼最高分為3分。因此,疫苗及佐劑對(duì)兔眼結(jié)膜雖有輕度刺激性,但仍然在正常值范圍內(nèi),且該刺激性主要來(lái)源于佐劑。該疫苗是油佐劑疫苗,油佐劑的作用是使機(jī)體對(duì)藥物不易吸收,對(duì)藥物起緩釋與長(zhǎng)效作用。在對(duì)兔股四頭肌部位注射疫苗及佐劑后,剖檢,在注射部位,有少量的白色干酪物,在給藥部位有輕度的充血,這可能與該油佐劑不易吸收有關(guān),刺激反正仍在正常值范圍內(nèi),故可用于注射給藥。溶血試驗(yàn)表明,H5N1亞型禽流感油佐劑疫苗未見對(duì)紅細(xì)胞有凝集和溶血作用,其滲透壓不會(huì)影響動(dòng)物細(xì)胞的正常形態(tài)及穩(wěn)定,符合注射劑的要求。上述結(jié)果提示,該疫苗安全性良好。

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