一株產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌兼性厭氧液體發(fā)酵動力學(xué)的研究

賈翠英，歐行奇，王永輝

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

纖維素是世界上最大的可再生有機資源，我國的纖維類資源極為豐富，僅秸稈和皮殼每年可達7×108t。目前對其主要的利用方式是作為低級燃料，腐化為肥和家畜過腹還田，因此，有效利用率低。

當(dāng)前，許多國家已展開對纖維素利用的深入研究，主要集中在兩個方面：首先酶的基礎(chǔ)研究，即纖維素酶如何使一束纖維從不可溶的聚合物上脫離下來，催化的化學(xué)機制以及纖維素酶如何相互作用以實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)；其次是酶在實現(xiàn)生物量轉(zhuǎn)化過程中的應(yīng)用，即利用纖維素酶轉(zhuǎn)化可再生性的能源物質(zhì)生產(chǎn)化工原料等[1]。然而，由于纖維素酶活力低，一直是阻礙大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的瓶頸，加強纖維素酶產(chǎn)生菌菌種選育、發(fā)酵工藝及降解機制的基礎(chǔ)研究，利用高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類的微生物技術(shù)，將天然纖維素降解為可利用的糖液，再進一步轉(zhuǎn)化為乙醇、乳酸、菌體蛋白、氣體燃料等物質(zhì)，對解決能源危機和環(huán)境污染以及生態(tài)保護是可行的，同時也是必要的[2-5]。纖維素酶對纖維素的降解作用主要通過纖維素外切酶（1,4-β-D-glucan-cellbiohydrolases，EC 3.2.1.91,CBH）、內(nèi)切酶（1,4-β-D-glucan-4-glucanases,3.2.1.4,EG）和纖維二糖酶（β-D-cellobiase,EC 3.2.1.21）三類酶的協(xié)同作用[6-8]，不同來源的菌株其纖維素酶的分子特征和催化性質(zhì)都不盡相同，且酶的最適反應(yīng)條件也有所不同[9-12]。微生物反應(yīng)動力學(xué)包括細胞生長動力學(xué)、代謝產(chǎn)物生成動力學(xué)和基質(zhì)消耗動力學(xué)[13]，通過對微生物反應(yīng)動力學(xué)的研究和模型的建立，能更好的認(rèn)識微生物發(fā)酵過程中菌體的生長和產(chǎn)物形成機制，以及影響這些機制的一些重要因素，最終實現(xiàn)發(fā)酵過程的有效控制，達到提高產(chǎn)物發(fā)酵指標(biāo)的目的。

本文以本實驗室從羊瘤胃中篩選分離保存的一株絲狀真菌為研究對象，通過靜置液體發(fā)酵試驗，對該絲狀真菌體外轉(zhuǎn)化玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵動力學(xué)進行了研究，并對動力學(xué)方程進行了模擬驗證,獲得較理想的結(jié)果，從而為進一步研究和利用其所產(chǎn)纖維素酶降解玉米秸稈纖維素提供必要的理論依據(jù)，同時對于環(huán)境保護、資源能源再利用等領(lǐng)域具有極大地實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

一株產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌，由河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院發(fā)酵工程實驗室篩選、分離、保存并提供,該菌株經(jīng)分類鑒定為子囊菌屬絲狀真菌（Ascomycotinas sp.）。

1.2 試驗原料

玉米秸稈，新鄉(xiāng)市郊外田地里采集，100℃烘干，粉碎，過40目篩待用。

1.3 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基：土豆汁100 mL，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：土豆汁100 mL，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖2%，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆汁100 mL，玉米秸稈12.5%（W/V），pH自然。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

無菌操作將所試絲狀真菌接種于斜面培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)72 h，連續(xù)活化兩代。

1.4.2 液體種子培養(yǎng)

無菌操作將所試絲狀真菌斜面培養(yǎng)物接種于盛有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

無菌操作將上述種子液按8%的接種量接種盛有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，37℃靜置發(fā)酵。

1.4.4 菌體生物量的測定[14]

菌體生物量的測定采用生理指標(biāo)法中的菌體含碳量測定進行描述。

1.4.5 產(chǎn)物CMC-Na酶活力的測定

以CMC-Na酶為代表進行產(chǎn)物纖維素酶活力測定，其方法采用DNS試劑法[15]。首先進行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，然后依照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟進行發(fā)酵液中產(chǎn)物纖維素酶活性的測定。酶活定義為：1 mL粗酶液在1 min分解底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個酶活單位（U）。酶活計算方法如下：酶活=稀釋酶活測定值×1 000×稀釋倍數(shù)/反應(yīng)時間。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 1 Preparation of standard curve of glucose(mL)

1.4.6 底物玉米秸稈纖維素消耗的測定

利用硫酸蒽酮法測定纖維素含量[16]，取6支小試管，按照表2分別加入各種試劑，塞上塞子、充分混勻后靜置1 min，然后在620 nm下，測定不同含量纖維素溶液的吸光度，以測得的吸光度為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)表示纖維素含量，繪制纖維素含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵液中纖維素含量測定同纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟。

表2 纖維素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Table 2 Preparation of standard curve of cellulose (mL)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線

重鉻酸鉀法測定生物量所制作的菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，菌體濃度在0.1～0.8 g·L-1范圍內(nèi)時，吸光度與菌體濃度成正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)R2=0.99546,可知該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用于菌體生物量的計算，可為菌體生長動力學(xué)模型建立和驗證時的數(shù)據(jù)計算提供依據(jù)。

圖1 菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of mycelium biomass

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

DNS法測定葡萄糖含量所制作的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，由圖2可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度在0.1～0.35 g·L-1范圍內(nèi)時，吸光度和葡萄糖濃度之間有著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.99554，可知該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線能較好地進行產(chǎn)物CMC-Na酶活力的測定和計算，為產(chǎn)物酶形成動力學(xué)模型建立和驗證時的數(shù)據(jù)計算提供依據(jù)。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

硫酸蒽酮法測定基質(zhì)纖維素含量所繪制的纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。由圖3可知，纖維素濃度在40～180 mg·L-1范圍內(nèi)，吸光度和纖維素濃度具有良好的線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)R2=0.99228?？芍摾w維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于玉米秸稈中纖維素含量變化的計算，從而用于基質(zhì)纖維素消耗動力學(xué)模型建立和驗證時的數(shù)據(jù)計算提供依據(jù)。

圖3 纖維素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of cellulose content

2.4 批式發(fā)酵試驗結(jié)果

批式發(fā)酵結(jié)果如圖4(a，b)。該絲狀真菌的各個生長階段比較分明。菌體生長的延滯期較長，18 h后逐步進入對數(shù)生長期，當(dāng)發(fā)酵至72 h左右時，菌體生長達到穩(wěn)定期，此后細胞生物量維持恒定，96 h獲得最大菌體干重為9.046 g·L-1。纖維素基質(zhì)含量的變化為逐漸降低趨勢。而由產(chǎn)物酶的形成曲線可知，產(chǎn)物酶的形成與細胞的生長是同步的，其二者的關(guān)系表現(xiàn)為偶聯(lián)型，即菌體快速生長時產(chǎn)物酶也大量積累生成，菌體生長穩(wěn)定期時產(chǎn)物酶不在大量積累而基本維持恒定。此外，由圖4還可知，底物纖維素消耗曲線、細胞生長曲線和產(chǎn)物酶的形成曲線三者有一定的相關(guān)性，即細胞在對數(shù)生長期時，對底物的利用速度較快。

圖4 批式發(fā)酵試驗結(jié)果Fig.4 Results of batch fermentation

2.5 細胞生長動力學(xué)模型

在子囊菌屬絲狀真菌(Ascomycotinas sp.)轉(zhuǎn)化玉米秸稈纖維素的分批發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度底物對該絲狀真菌產(chǎn)生抑制，因此，不宜采用經(jīng)典的Monod模型來描述其細胞生長動力學(xué)特征。Logistic方程能很好地反映分批發(fā)酵過程菌體生長與底物濃度之間的動力學(xué)過程，具有廣泛的適用性。Logistic方程為：

式中，Cx為細胞濃度（g·L-1DW），Cxm為最大細胞濃度（g·L-1DW），μm為最大比生長速率（h-1）。以t=0時，Cx=Cx0為初始條件，上式積分后，可得：

將（2）式整理后得：

2.6 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型

Gaden根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細胞生長速率之間的關(guān)系，將其分為三種類型：生長偶聯(lián)模型；混合模型又稱為Luedeking-Piret模型和非生長偶聯(lián)模型。從該絲狀真菌分批發(fā)酵試驗結(jié)果來看，產(chǎn)物CMC-Na酶的生成是伴隨在菌體生長過程中的，可采用生長偶聯(lián)模型描述產(chǎn)物酶的生成動力學(xué)特征。

生長偶聯(lián)模型的數(shù)學(xué)表達式為：

穩(wěn)態(tài)時，dCx/dt=0，Cx=Cxm

將式（4）積分后得：

式（5）可簡寫為如下形式：

其中，

式(7)中 μm，Cxm，Cx0均已知，以 [CP] 對 A（t）作圖，直線斜率即為α值。

2.7 底物消耗動力學(xué)模型

底物消耗主要用于三個方面：細胞生長消耗；細胞維持基本生命活動消耗；合成代謝產(chǎn)物的消耗。因此可用如下動力學(xué)方程表示：

式中，CS為基質(zhì)濃度（mg·L-1），CX為細胞濃度（g·L-1，干重），CP為酶活力單位（U·L-1），m 為細胞的維持系數(shù)（s-1），Yx/s為菌體相對于基質(zhì)的得率系數(shù)（g細胞·mg-1基質(zhì)），其定義為生成細胞的干重與用于細胞生長而消耗基質(zhì)的質(zhì)量之比。Yp/s為產(chǎn)物相對于基質(zhì)的得率系數(shù)（U·mg-1基質(zhì)）。

將式（4）代入式（8）后得：

式(9)可簡化為：

由于維持細胞生長的消耗很小，所以可以忽略不計，即=0

式(10)可簡化為：

將式(11)積分后得：

式(12)簡化為：

式（13）中 γ 可由式（11）得到，μm，Cxm，Cx0均已知，以[Cs0-Cs]對C（t）作圖，直線斜率即為γ值。

2.8 模型求解

將上述各個動力學(xué)模型根據(jù)試驗數(shù)據(jù)利用計算機模擬求解，得模型中的各個參數(shù)及試驗初始條件如表3所示：

表3 動力學(xué)模型參數(shù)及初始條件Table 3 Parameters value in the kinetic models and initial conditions of batch fermentation for filamentous fungi

2.9 模型的驗證

在已知試驗條件下，進行絲狀真菌分批轉(zhuǎn)化玉米秸稈纖維素的重復(fù)試驗，分別測定細胞生長，產(chǎn)物酶合成及底物纖維素消耗并繪制曲線，然后對分批發(fā)酵試驗的試驗值與動力學(xué)模型曲線的模型值進行擬合，得圖5～7。

圖5 細胞生長模型值與試驗值比較Fig.5 Comparison of cell growth model value and test value

圖6 產(chǎn)物酶動力學(xué)模型值與試驗值比較Fig.6 Comparison of enzyme activity model value and test value

圖7 纖維素消耗動力學(xué)模型值與試驗值比較Fig.7 Comparison of cellulose consumption model value and test value

圖7分別顯示了細胞生長的模型值，產(chǎn)物酶合成的模型值和底物消耗的模型值與試驗實測值擬合程度，其相對誤差分別為0.1998、5.9035和0.00072，相關(guān)系數(shù)分別為 0.98827、0.98283和0.99599，結(jié)果顯示了所建底物消耗動力學(xué)模型能夠很好地描述絲狀真菌兼性厭氧液體發(fā)酵過程中對基質(zhì)的消耗規(guī)律；而所建立的細胞生長動力學(xué)模型和產(chǎn)物合成動力學(xué)模型只是基本能較好的反映微生物的實際生長和產(chǎn)酶過程，其模型值與實測值的相對誤差均大于15%。分析可知造成較高相對誤差的區(qū)域主要分布在菌體生長的對數(shù)期后期，此時由于菌體生長所需的營養(yǎng)開始出現(xiàn)匱乏，造成部分菌體生長速率下降甚至開始出現(xiàn)菌體死亡，因此，所測試驗值與模型值出現(xiàn)較大偏差。此外，由于菌體產(chǎn)酶動力學(xué)特征顯示其產(chǎn)酶與菌體生長表現(xiàn)為偶聯(lián)型，因此造成產(chǎn)物酶合成的模型值與實測值也表現(xiàn)為較高的相對誤差。再者，造成產(chǎn)物合成動力學(xué)模型值與試驗實測值相對誤差較大的另一方面的原因可能是微生物所產(chǎn)纖維素酶系為一復(fù)合酶系，其他酶如纖維素外切酶，β-葡萄糖苷酶等的存在可能對CMC-Na酶活大小有一定影響。

3 討論與結(jié)論

微生物發(fā)酵動力學(xué)是生物反應(yīng)工程學(xué)的理論基礎(chǔ)，通過數(shù)學(xué)模型定量表達發(fā)酵過程中各種與微生物生長、基質(zhì)消耗和產(chǎn)物形成有關(guān)的因素，可進一步了解微生物的生理特征，菌體生長和產(chǎn)物形成的合適條件，以及各發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系，從而為發(fā)酵過程的工藝控制，反應(yīng)器放大以及利用計算機對發(fā)酵過程實現(xiàn)自動化控制創(chuàng)造條件。

不同的微生物具有不同的生長代謝特性和代謝規(guī)律，通過建立微生物的發(fā)酵動力學(xué)數(shù)學(xué)模型可以更好地發(fā)揮微生物自身特點以實現(xiàn)更有效的發(fā)酵和控制，從而最大限度地獲得理想產(chǎn)物。Logistic方程和Luedeking-Piret方程對于描述微生物生長、基質(zhì)消耗和產(chǎn)物形成具有廣泛適應(yīng)性，然而，微生物發(fā)酵過程的復(fù)雜性以及影響因素的多變性，使得所建發(fā)酵動力學(xué)模型并不能完全反映實際的微生物發(fā)酵過程。為此，在以后的研究過程中需要對實際發(fā)酵過程進行多次優(yōu)化以及對所建模型進行修正和補充，使模型值與試驗數(shù)據(jù)擬合較好。

本文通過Logistic方程和Luedeking-Piret方程，獲到了產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌的兼性厭氧液體發(fā)酵動力學(xué)模型包括細胞生長動力學(xué)模型、底物消耗動力學(xué)模型及產(chǎn)物酶合成動力學(xué)模型及模型的參數(shù)，并對試驗實測值與模型值進行了驗證比較。結(jié)果表明，模型計算值與試驗值擬和良好，相關(guān)系數(shù)分別為：0.98827、0.98283和0.99599，所建模型能較好地描述該絲狀真菌生物降解玉米秸稈產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵動力學(xué)特征，該研究不同于以往報道中的生產(chǎn)菌株大多為好氧微生物[17-20]，該菌為兼性厭氧微生物，在發(fā)酵產(chǎn)酶上具有顯著優(yōu)勢，研究其兼性厭氧發(fā)酵動力學(xué)對于進一步優(yōu)化其產(chǎn)酶條件和提高產(chǎn)酶能力具有一定的參考價值和理論意義。

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