雞痘DNA疫苗pV AX-env的構(gòu)建及其體內(nèi)外表達

洪 琴，任曉峰，李廣興

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雞痘是由雞痘病毒（Fowlpox virus,FPV）引起的一種急性接觸性傳染病，各年齡和品種的雞都易感染，但雛雞的敏感性最高[1]。雞痘分為白喉型，皮膚型，和混合型。其特征是在雞的無毛或少毛的皮膚上發(fā)生痘疹，或在雞口腔、咽喉部黏膜形成纖維素性壞死性假膜。雞只患該病后增重緩慢、消瘦，產(chǎn)蛋量暫時下降[2]。近年來，雞痘鵪鶉化弱毒苗對雞群進行刺種免疫，但常出現(xiàn)免疫失敗，雞群發(fā)生典型雞痘或非典型雞痘的報道，給養(yǎng)雞戶造成很大的經(jīng)濟損失[3-4]。目前國內(nèi)外雞痘疫苗研究主要集中于重組雞痘病毒的構(gòu)建，而對于雞痘病毒DNA疫苗的研究幾乎沒有。雞痘病毒囊膜蛋白由雞痘病毒ORF140編碼，為痘苗病毒H3L編碼的P35蛋白的同系物，在痘病毒屬內(nèi)氨基酸序列高度保守。env蛋白對細胞內(nèi)成熟病毒結(jié)合到細胞膜上起重要作用[5]。本試驗選取雞痘病毒env基因為目的基因,構(gòu)建了含有該基因的真核表達質(zhì)粒pVAX-env，并進行體外瞬時轉(zhuǎn)染和體內(nèi)免疫試驗，經(jīng)免疫熒光和RT-PCR檢測證明pVAX-env在體內(nèi)體外都能進行表達，為深入分析env蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細胞、真核表達載體

pVAX1、大腸桿菌JM109由本實驗室保存，含有env基因的質(zhì)粒本實驗室構(gòu)建，命名為pMD18-T-env。BHK21細胞由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

T4DNA連接酶、exTaqDNA聚合酶、dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶PstⅠ和XhoⅠ、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Oligod(T)、Rnase抑制劑、核酸分子質(zhì)量標準等購自TaKaRa公司，Trizol和脂質(zhì)體-2000購自Invitrogen公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。兔抗env蛋白多抗血清由本實驗室制備，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG(第二抗體)購于北京中杉公司。1日齡雛雞購自東農(nóng)孵化場。

1.2 方法

1.2.1 FPV env基因的亞克隆

根據(jù)pMD18-T-env的測序結(jié)果設(shè)計了兩對亞克隆引物，ENV-PVAXU：AAAACTGCAGCCGCCA TGGCGCCGGGCGACA；ENV-PVAXL：CCCGCTC GAGTTACATAGAATACGCT。其中上游引物ENVPVAXU含有PstI酶切位點，并在起始密碼子ATG前插入序列CCGCC構(gòu)成Kozak序列。下游引物ENV-PVAXL含有XhoⅠ酶切位點。理論上可擴增993 bp。

以pMD18-T-env質(zhì)粒為模板進行PCR擴增按照文獻方法[6-7]采用25 μL體系：

10×PCR 緩沖液（含 2.5 mmol·L-1MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL， 2.5 U exTaq 0.25 μL，25 pmol·L-1的上下游引物各 0.5 μL，模板 0.5 μL，最后用雙蒸水補至25 μL。

PCR條件為95℃預(yù)變性模板2 min；94℃變性1 min；53.9℃退火30 s；72℃延伸1 min共30個循環(huán)，72℃終延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.2 重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將上述PCR產(chǎn)物分別用PstⅠ和XhoⅠ雙酶切，并與同樣雙酶切的融合表達載體pVAX1用T4DNA連接酶在16℃金屬浴中過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落小量制備質(zhì)粒后進行菌液PCR和雙酶切初步鑒定。

1.2.3 重組真核質(zhì)粒的體外瞬時轉(zhuǎn)染

將BHK21細胞接種于24孔板中，在細胞達到80%的融合時開始轉(zhuǎn)染。取2 μg重組質(zhì)粒和2 μL LipofectamineTM2000，分別用100 μL無抗生素、無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋；靜置5 min后將兩者混勻，室溫孵育30 min，以便脂質(zhì)體充分包裹質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染BHK21細胞，24～48 h后用間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染基因的表達。

1.2.4 間接免疫熒光檢測重組質(zhì)粒體外表達

瞬時轉(zhuǎn)染24 h后取出蓋玻片，按照文獻[7]免疫熒光法檢測目的蛋白表達：用0.01 mol·L-1預(yù)冷PBS（pH 7.2）清洗3次；用4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min，PBS清洗3次；冷丙酮4℃固定10 min，PBS漂洗。0.1%Triton-X100室溫 5 min，PBS漂洗。然后加入兔抗env多抗血清1∶100稀釋，37℃作用1 h，PBS清洗3次；加入1∶200稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG二抗，室溫避光作用45 min，PBS清洗3次；再用中性甘油封片,熒光顯微鏡下觀察表達情況，以同時轉(zhuǎn)染PVAX空載體的BHK21細胞為陰性對照。

1.2.5 重組真核質(zhì)粒的體內(nèi)試驗

堿裂解法大量制備真核表達質(zhì)粒方法參照文獻[8]。

14日齡商品蛋公雞 (1日齡購自東農(nóng)孵化場)30只分為兩組。各組雞只接種前15 min先在接種部位注射25%的蔗糖溶液100 μL輕柔5 min，第一組胸肌注射 PBS 100 μL只-1，第二組胸肌注射pVAX-env重組真核質(zhì)粒100 ug只-1。注射后24 h，48 h，72 h，7 d，14 d分別采取注射部位的肌肉、皮膚、標記好于-80℃保存。

1.2.6 RT-PCR檢測

Trizol法提取組織總RNA按照文獻方法[9]，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL總RNA 10 μL，Oligod(T)2 μL，70 ℃ 10 min 冰上 2 min。RNase Inhibitor 0.5 μL，5×M-MV 緩沖液 4 μL，MMLV 酶 1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，RNase free H2O。42℃水浴1 h,70℃15 min。以cDNA為模板，同1.2.1方法進行PCR擴增。

1.2.7 免疫組織化學(xué)檢測重組真核質(zhì)粒體內(nèi)表達

取出組織，修成適當?shù)男K，使用冰凍切片機把組織切成8～9 μm切片，粘附在APES處理過的載玻片上。室溫干燥1 h，80%丙酮4℃固定過夜，室溫干燥10 min后PBS清洗3次，10%馬血清室溫封閉20 min，一抗：兔抗env多抗血清1∶100稀釋，室溫孵育2 h。PBS清洗3次，孵育1∶200稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG二抗，室溫避光1 h。PBS清洗3次，再用中性甘油封片，熒光顯微鏡下觀察表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞痘病毒囊膜蛋白的亞克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，約993 bp。將其亞克隆到pVAX1載體上，得到重組質(zhì)粒pVAX-env。通過菌落PCR和重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到一個約993 bp的條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符(見圖1)。

圖1 重組陽性質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Gel electrophoresis on enzyme digestion of pVAX-env

2.2 間接免疫熒光檢測

通過細胞免疫熒光技術(shù)，在熒光顯微鏡下，瞬時轉(zhuǎn)染pVAX-env質(zhì)粒的BHK21細胞可以觀察到特異性的綠色熒光信號主要分布在胞漿（見彩版Ⅰ），而瞬時轉(zhuǎn)染PVAX空載體的BHK21細胞無明顯的熒光信號（見彩版Ⅱ）。

2.3 RT-PCR檢測pVAX-env的體內(nèi)表達

提取免疫PVAX-env后和使用注射PBS的雛雞免疫部位肌肉組織的總RNA，使用引物ENVPVAXU和ENV-PVAXL進行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，免疫后722 h即可檢測到env的RNA，而PBS組無明顯特異性條帶（見圖2）。

圖2 體內(nèi)表達試驗RT-PCR結(jié)果Fig.2 RT-PCR identification of env mRNA in vivo expression experiment

2.4 組織免疫熒光檢測pVAX-env的體內(nèi)表達

取72 h pVAX-env組和PBS組帶皮的肌肉組織制作冰凍切片，間接免疫熒光檢測pVAX-env體內(nèi)表達情況。pVAX-env組肌肉組織在肌膜、肌束膜（見彩版Ⅲ）和肌纖維間隙浸潤的淋巴細胞胞漿內(nèi)可見特異性的熒光（見彩版Ⅲ箭頭）。而PBS對照組無明顯熒光（見彩版Ⅳ）。

3 討論與結(jié)論

近年來，在已免疫的雞群中常有雞痘的爆發(fā)。說明現(xiàn)用的雞痘鵪鶉化弱毒苗不能提供針對雞痘病毒的有效地保護。其爆發(fā)的原因包括新抗原變異株的出現(xiàn)；活疫苗弱毒株由于反復(fù)接種傳代，可能出現(xiàn)毒力返祖，造成毒力增強而爆發(fā)雞痘；還有一些報道雞痘疫苗有REV污染引起REV相關(guān)疾??；在美國和澳大利亞的研究表明雞痘分離株和疫苗株中整合有完整的REV前病毒[10]。整合有完整的REV前病毒的FPV可能加強感染雛雞致病性。更有報道認為REV前病毒的整合早在50年前就已經(jīng)發(fā)生了[4]。我國的研究也發(fā)現(xiàn)分離的野毒株中含有REV的前病毒基因序列,國產(chǎn)疫苗當中也整合有REV的LTR序列[11-12]。甚至重組雞痘病毒疫苗也整合有REV前病毒序列。而且不同病原的重組雞痘病毒 (rFPV)在

雞群進行間隔性的多次免疫時，后期免疫會受到前期免疫所誘生的載體特異性免疫反應(yīng)的干擾，并導(dǎo)致其免疫效力下降[13]。對于雛雞體內(nèi)的母源抗體對于雞痘鵪鶉化弱毒苗和重組雞痘病毒疫苗免疫有一定的影響[14]。DNA疫苗是一種新型的基因工程疫苗，它將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的重組質(zhì)粒作為疫苗直接導(dǎo)入機體細胞內(nèi)，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，從而使被接種機體獲得相應(yīng)的免疫保護而達到防病治病的目的。其安全有效，使用簡便，可長期在宿主細胞內(nèi)表達而使機體獲得持續(xù)性的免疫力且不受母源抗體的影響等優(yōu)點而越來越受到人們的重視，被看作是繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第3代疫苗[15]。雞痘病毒FPV140編碼病毒的囊膜蛋白沒有保守的糖基化位點。一個短的N端疏水序列和一個長的C端疏水區(qū)在所有同系物中都保守。N端不是信號肽序列所以不能轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，C端疏水區(qū)預(yù)測為跨膜區(qū)。這個疏水區(qū)是它到IMV膜入點。FPV140蛋白和VACV H3L蛋白一樣，有豐富的堿性殘基和包含潛在的硫酸乙酰肝素結(jié)合位點。這說明FPV140蛋白，像他的VACV同系物，能夠有功能使IMV結(jié)合到細胞膜[4]。本試驗構(gòu)建了雞痘DNA疫苗pVAX-env真核表達質(zhì)粒，并成功的證明其在體內(nèi)外都能獲得表達，為進一步進行雞痘病毒核酸疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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