反應(yīng)條件對(duì)啤酒中雙乙酰檢測(cè)結(jié)果的影響

張宗煜，李亞淑，李瑞云，郭興旺

(1. 天津市工業(yè)微生物研究所有限公司 天津300462；2. 天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司 天津300462；3. 天津市工業(yè)微生物工程技術(shù)中心 天津300462；4. 天津市工業(yè)微生物企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300462；5. 天津量信檢驗(yàn)認(rèn)證技術(shù)有限公司 天津300462)

1 雙乙酰簡(jiǎn)介

雙乙酰，又名丁二酮、2，3-丁二酮、二甲基乙二酮等。在自然界，丁二酮天然發(fā)現(xiàn)于草莓、奶油、牛奶、咖啡、當(dāng)歸、肉豆蔻、覆盆子、鳶尾油、月桂油、葡萄酒、芹菜籽油等產(chǎn)物中。它是黃油和其他一些天然產(chǎn)物香味的主要成分。

1.1 啤酒中的雙乙酰

雙乙酰是一種天然發(fā)酵副產(chǎn)品，常在含酒精飲料中自然生成。雙乙酰在啤酒中的含量是決定啤酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。國標(biāo) GB/T 4927—2008對(duì)淡色啤酒，即色度在2～14EBC的啤酒中(EBC指國際通用色標(biāo)，即歐洲釀酒協(xié)會(huì)European Brewery Convention規(guī)定的，用來對(duì)啤酒色度進(jìn)行分級(jí)的色度單位)雙乙酰含量有著明確的要求，即優(yōu)級(jí)品≤0.10mg/L，一級(jí)品≤0.15mg/L，并且特別規(guī)定了如果雙乙酰含量不合格，該啤酒樣品屬于嚴(yán)重瑕疵，如果有一項(xiàng)嚴(yán)重瑕疵，且復(fù)驗(yàn)仍存在，可以判定該批樣品為不合格[1-2]。

1.2 其他食品中的雙乙酰

啤酒中的丁二酮是在發(fā)酵過程產(chǎn)生的，除了啤酒，丁二酮在其他食品中也是允許添加的食品添加劑，常作為食品添加劑以增加黃油口味，丁二酮在食品工業(yè)中用作糖果、餅干、人造黃油等食品的增香劑，也可用作明膠的硬化劑。丁二酮與3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)一樣，是可以使黃油帶上其獨(dú)特口感的化合物。正因如此，食品生產(chǎn)商在人造黃油或類似油類食品終產(chǎn)品中添加丁二酮與 3-羥基-2-丁酮(同時(shí)添加β-胡蘿卜素以增加黃色)，在低度酒精飲料如啤酒或葡萄酒中少量添加丁二酮有助于增加滑溜的口感。隨著添加量的增多，會(huì)造成一種類似黃油或奶油的味道，天然奶油也含有少量的丁二酮。丁二酮是發(fā)酵合成纈氨酸的副產(chǎn)物，在合成過程中，酵母產(chǎn)生的 α-乙酰乳酸從細(xì)胞內(nèi)放出并自發(fā)脫羧生成丁二酮，酵母重新吸收丁二酮并還原其羰基生成無味的 3-羥基-2-丁酮與 2，3-丁二醇。啤酒生產(chǎn)有時(shí)會(huì)有“丁二酮休息”，即發(fā)酵完成后兩三天略微提高溫度，以使酵母能吸收先前發(fā)酵歷程中生成的丁二酮。有的葡萄酒生產(chǎn)商，為了其口感有意促進(jìn)丁二酮的生成。國標(biāo)GB 2760—2014把它作為“允許使用的食品用合成香料”[3]，美國香味料和萃取物制造者協(xié)會(huì)(Flavour and Extract Manufacturers Association，F(xiàn)EMA)把雙乙酰作為“一般認(rèn)為安全”(generally recognized as safe，GRAS)的食品添加劑，并規(guī)定了雙乙酰在一些食品中的允許使用限量(mg/kg，ppm)[4]，見表1。

表1 FEMA規(guī)定的雙乙酰在食品中的允許使用限量Tab.1 Allowable use limits of diacetyl in food specified by FEMA

2 現(xiàn)行雙乙酰的檢測(cè)方法及可能存在的問題

在國標(biāo)GB/T 4928—2008中，雙乙酰的檢測(cè)是通過蒸餾，將啤酒中的雙乙酰與其他雜質(zhì)分離，再使蒸出的雙乙酰與鄰苯二胺[o-C6H4(NH2)2]反應(yīng)，生成2，3-二甲基喹喔啉，并在 335nm 下測(cè)定產(chǎn)物的吸光度[5]。所涉及的反應(yīng)如圖 1—圖 3所示(R1、R2、R3代表不同基團(tuán))。

鄰苯二胺[o-C6H4(NH2)2]屬于芳香族伯胺，與羰基化合物生成的亞胺穩(wěn)定性相對(duì)較高，可以分離出來。特別是在雙乙酰的檢測(cè)中，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到氨基醇脫水形成亞胺(圖 2)這一階段時(shí)，由于碳氮雙鍵和苯環(huán)共軛，再加上 1，2-二酮與 1，2-二胺這種特殊的空間位置，生成了一個(gè)穩(wěn)定性很高的芳香雜環(huán)化合物。在這個(gè)過程中，產(chǎn)物 2，3-二甲基喹喔啉的芳香性促進(jìn)了反應(yīng)朝正向進(jìn)行，而不會(huì)在酸性水溶液中水解。反應(yīng)歷程如圖4、圖5所示。

圖1 伯胺與羰基化合物生成氨基醇Fig.1 Formation of amino alcohols from primary amines and carbonyl compounds

圖2 氨基醇脫水形成亞胺Fig.2 Dehydration of amino alcohol to form imine

圖3 亞胺在酸性條件水解Fig.3 Hydrolysis of imine in acid condition

圖4 雙乙酰與鄰苯二胺生成氨基醇Fig.4 Formation of amino alcohol by diacetyl and ophenylenediamine

圖5 2，3-二甲基喹喔啉的生成Fig.5 Formation of 2，3-dimethyl quinoxaline

由反應(yīng)方程式可以看出，該反應(yīng)會(huì)生成水。根據(jù)化學(xué)反應(yīng)平衡移動(dòng)原理，如果能在反應(yīng)過程中及時(shí)把水移出反應(yīng)體系，會(huì)促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行。但在國標(biāo)GB/T 4928—2008中，要用 4mol/L的鹽酸配制鄰苯二胺溶液，再用這個(gè)溶液和雙乙酰反應(yīng)。因?yàn)猷彵蕉?鹽酸溶液中的鄰苯二胺含量較低，所以該反應(yīng)體系中大部分是水，理論上會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行。為了驗(yàn)證這個(gè)想法，我們?cè)O(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)：按照國標(biāo) GB/T 4928—2008進(jìn)行操作；將蒸餾出來的雙乙酰與鄰苯二胺/乙醇溶液反應(yīng)，并對(duì)比2個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定比較好的反應(yīng)溶劑，再進(jìn)行鄰苯二胺使用量的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3 雙乙酰檢測(cè)研究回顧

在以往的文獻(xiàn)中，對(duì)比色法檢測(cè)啤酒中雙乙酰含量有一些研究。

張祥強(qiáng)[6]研究認(rèn)為啤酒中雙乙酰的含量會(huì)隨著樣品保存溫度、消泡劑使用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、比色時(shí)間的增加而升高，反應(yīng)不避光要比避光時(shí)檢測(cè)結(jié)果高，臟的比色皿會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏高，使用不同消泡劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有影響。

鄧鳳仙[7]研究認(rèn)為啤酒及蒸餾水(空白)中雙乙酰的含量均會(huì)隨著消泡劑使用量的增加而升高，消泡劑種類對(duì)樣品及蒸餾水(空白)的檢測(cè)結(jié)果也都有影響。

祝美云等[8]研究認(rèn)為啤酒中雙乙酰的含量會(huì)隨著比色時(shí)間、樣品保存溫度的增加而升高，甚至可以達(dá)到不合格的標(biāo)準(zhǔn)，但這種“雙乙酰不合格”的啤酒，感官仍然合格。啤酒中雙乙酰的含量會(huì)隨著啤酒開瓶后放置時(shí)間的延長而升高，且此時(shí)感官也不合格。

曹利平[9]的研究是將啤酒在低于 5℃條件下，用2個(gè)燒杯以細(xì)流方式來回傾倒5次，將處理后的啤酒轉(zhuǎn)移到密閉容器中，于 60℃恒溫 1h，冷卻后再按照國標(biāo)法進(jìn)行檢測(cè)，認(rèn)為國標(biāo)法不能有效反映啤酒中雙乙酰和 α-乙酰乳酸的總量，經(jīng)過文獻(xiàn)的方法處理后，再檢測(cè)可以有效反映啤酒中雙乙酰和 α-乙酰乳酸的總量。

在以上文獻(xiàn)研究中，對(duì)于雙乙酰和鄰苯二胺的反應(yīng)均是按照國標(biāo)法操作。但沒有對(duì)于反應(yīng)溶劑、鄰苯二胺用量等方面的研究，因此本文對(duì)這些方面進(jìn)行了研究。

為保證反應(yīng)物雙乙酰的均一性，本文中的實(shí)驗(yàn)方法及操作與國標(biāo)法不同，所以只能通過檢測(cè)結(jié)果分析和化學(xué)反應(yīng)相關(guān)的問題，而不能以任何一個(gè)檢測(cè)結(jié)果來判斷某個(gè)啤酒樣品中的雙乙酰含量是否合格。

4 試驗(yàn)部分

4.1 試驗(yàn)藥品與儀器

試驗(yàn)藥品：鄰苯二胺(分析純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙醇(分析純)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；濃鹽酸(分析純)，利安隆博華(天津)醫(yī)藥化學(xué)有限公司；一級(jí)水，自制。

試驗(yàn)儀器：U-3010紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司。

4.2 反應(yīng)溶劑對(duì)比試驗(yàn)

4.2.1 溶液配制

4mol/L鹽酸：用濃鹽酸與一級(jí)水按 GB/T 601配制。

10g/L鄰苯二胺鹽酸溶液：稱取鄰苯二胺0.100g，用4mol/L鹽酸溶解，并定容到10mL。

10g/L鄰苯二胺乙醇溶液：稱取鄰苯二胺0.100g，用無水乙醇溶解，并定容到10mL。

4.2.2 蒸餾

蒸餾裝置見圖6。

圖6 雙乙酰蒸餾裝置Fig.6 Diacetyl distillation unit

蒸餾過程：向 5L蒸汽發(fā)生瓶中加入 1.5～2L水，從進(jìn)樣口中倒入樣品，將進(jìn)樣口塞住后再進(jìn)行水封，夾緊廢液排放管處的簧夾，打開冷卻水，用電爐加熱蒸汽發(fā)生瓶。收集器為 50mL比色管(外加冰浴)。

4.2.3 反應(yīng)

加 1～2滴消泡劑于 100mL量筒中，注入未經(jīng)除氣的預(yù)先冷卻至 5℃的酒樣 100mL，迅速轉(zhuǎn)移到蒸餾器中進(jìn)行蒸餾，直至餾出液在 50～60mL時(shí)取下比色管，恢復(fù)至室溫后混勻。分別吸取10mL餾出液于 4支干燥的 10mL比色管中，并于第 1支管中加入鄰苯二胺鹽酸溶液 0.5mL，第 2支不加(做空白)，第 3支管中加入鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第4支不加(做空白)，搖勻后放置暗處反應(yīng) 20～30min，反應(yīng)后于第 1支管中加入 4mol/L的鹽酸2mL，于第 2支管中加入 4mol/L的鹽酸 2.5mL，于第 3支管中加入無水乙醇 2mL，于第 4支管中加入無水乙醇2.5mL，混勻后于335nm波長下比色。

4.2.4 比色

將第2支比色管中的液體倒入10mm石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，調(diào)零，再將第 1支比色管中的液體倒入 10mm石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度。此數(shù)值為國標(biāo)法測(cè)定雙乙酰的吸光度結(jié)果，并根據(jù)國標(biāo)中的公式計(jì)算樣品中雙乙酰的含量。

將第4支比色管中的液體倒入10mm石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，調(diào)零，再將第 3支比色管中的液體倒入 10mm石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度。此數(shù)值為用鄰苯二胺乙醇溶液測(cè)定啤酒中雙乙酰的吸光度結(jié)果，并根據(jù)國標(biāo)中的公式計(jì)算樣品中雙乙酰的含量。

4.2.5 結(jié)果與分析

我們隨機(jī)抽取市售的8批啤酒，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，測(cè)出的吸光度結(jié)果及計(jì)算出的雙乙酰含量見表2。

表2 反應(yīng)溶劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.2 Effect of reaction solvent on test results

由上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，用鄰苯二胺乙醇溶液所測(cè)定的值均比用鄰苯二胺鹽酸溶液測(cè)定的值要高，部分甚至大于 2倍，說明在乙醇溶液中，雙乙酰與鄰苯二胺的反應(yīng)比在鹽酸溶液中更為徹底。據(jù)此可以認(rèn)為，雙乙酰和鄰苯二胺在乙醇溶液中反應(yīng)，所得到的檢測(cè)結(jié)果更能表示啤酒中雙乙酰的真實(shí)含量。因此在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)用乙醇作為反應(yīng)溶劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4.3 鄰苯二胺濃度對(duì)比實(shí)驗(yàn)

考慮到增加鄰苯二胺的量也會(huì)促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行，在確定乙醇是更合適的反應(yīng)溶劑后，又重新設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)：鄰苯二胺/乙醇溶液的濃度及用量遵守國標(biāo)GB/T 4928—2008；鄰苯二胺/乙醇溶液的用量不變，濃度改成飽和鄰苯二胺/乙醇溶液(計(jì)劃將濃度改成國標(biāo)中的5倍，配制過程中發(fā)現(xiàn)該濃度下鄰苯二胺不能完全溶于乙醇)。

4.3.1 溶液配制

10g/L鄰苯二胺乙醇溶液：稱取鄰苯二胺0.100g，用無水乙醇溶解，并定容到10mL。

飽和鄰苯二胺乙醇溶液：稱取鄰苯二胺 0.500g于 10mL比色管中，加無水乙醇至刻度，超聲渦旋至固體不再溶解，過濾后使用。

4.3.2 蒸餾及反應(yīng)

蒸餾裝置及蒸餾過程同 4.2.2，蒸餾結(jié)束并將蒸出液混勻后，分別吸取 10mL于 3支干燥的 10mL比色管中，并于第 1支管中加入 10g/L鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第 2支管中加入飽和鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第 3支管不加(做空白)，搖勻后放置暗處反應(yīng) 20～30min，反應(yīng)后于第 1、2支管中加入乙醇 2mL，于第 3支管中加入乙醇 2.5mL，混勻后于335nm波長下比色。

4.3.3 比色

將第3支比色管中的液體倒入10mm石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，調(diào)零，再將第 1支比色管中液體倒入 10mm 石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度，此數(shù)值為用 0.5mL 10g/L鄰苯二胺乙醇溶液測(cè)定啤酒中雙乙酰的吸光度結(jié)果，并根據(jù)國標(biāo)中的公式計(jì)算雙乙酰的含量。

將第2支比色管中的液體倒入10mm石英比色皿，放入紫外可見分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度，此數(shù)值為用 0.5mL飽和鄰苯二胺乙醇溶液測(cè)定啤酒中雙乙酰的吸光度結(jié)果，并根據(jù)國標(biāo)中的公式計(jì)算雙乙酰的含量。

4.3.4 結(jié)果與分析

我們隨機(jī)抽取市售的8批啤酒，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，測(cè)出的吸光度結(jié)果及計(jì)算出的雙乙酰含量見表3。

由上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)反應(yīng)溶劑都是乙醇，且加入體積一樣時(shí)，隨著鄰苯二胺的濃度增大，測(cè)定結(jié)果隨之升高。說明濃度低時(shí)，體系中有雙乙酰未參加反應(yīng)；當(dāng)濃度增大時(shí)，更多的雙乙酰參加了反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果升高。

表3 鄰苯二胺濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響Tab.3 Effect of o-phenylenediamine concentration on test results

在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步加大了鄰苯二胺的用量。

4.4 鄰苯二胺用量對(duì)比實(shí)驗(yàn)1

蒸餾裝置及蒸餾過程同 4.2.2，蒸餾結(jié)束并將蒸出液混勻后，分別吸取 10mL于 4支干燥的 10mL比色管中，并于第 1支管中加入 10g/L鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第 2支管中加入飽和鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第 3支管中加入飽和鄰苯二胺乙醇溶液 2.5mL，第 4支管不加(做空白)，搖勻后放置暗處反應(yīng) 20～30min，反應(yīng)后于第 1、2支管中加入乙醇2mL，第 3支管不加，于第 4支管中加入乙醇2.5mL，混勻后于335nm波長下比色。

我們隨機(jī)抽取市售的8批啤酒，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，測(cè)出的吸光度結(jié)果及計(jì)算出的雙乙酰含量見表4。

表4 鄰苯二胺用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響1Tab.4 Effect of o-phenylenediamine dosage on test results(1)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)反應(yīng)溶劑都是乙醇，且加入體積一樣時(shí)，隨著鄰苯二胺的濃度增大，測(cè)定的結(jié)果隨之升高。在鄰苯二胺溶液濃度相同時(shí)，隨著加入體積的增加，測(cè)定的結(jié)果進(jìn)一步升高。說明鄰苯二胺用量少時(shí)，體系中有雙乙酰未參加反應(yīng)；隨著鄰苯二胺用量增大，更多的雙乙酰參加了反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果升高。

在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們將鄰苯二胺的用量加大到“極限”。

4.5 鄰苯二胺用量對(duì)比實(shí)驗(yàn)2

蒸餾裝置及蒸餾過程同 4.2.2，蒸餾結(jié)束并將蒸出液混勻后，分別吸取 10mL于 5支干燥的 25mL比色管中，并于第 1支管中加入 10g/L鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第 2支管中加入飽和鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL，第 3支管中加入飽和鄰苯二胺乙醇溶液 2.5mL，用飽和鄰苯二胺乙醇溶液將第 4支管定容至 25mL，第 5支管不加(做空白)，搖勻后放置暗處反應(yīng) 20～30min，反應(yīng)后于第 1、2支管中加入乙醇 2mL，第 3、4支管不加，于第 5支管中加入乙醇2.5mL，混勻后于335nm波長下比色。

我們隨機(jī)抽取市售的8批啤酒，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，測(cè)出的吸光度結(jié)果及計(jì)算出的雙乙酰含量見表5。

表5 鄰苯二胺用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響2Tab.5 Effect of o-phenylenediamine dosage on test results(2)

由上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)反應(yīng)溶劑都是乙醇，且加入體積一樣時(shí)，隨著鄰苯二胺的濃度增大，測(cè)定的結(jié)果隨之升高；在鄰苯二胺濃度相同時(shí)，隨著加入體積的增加，測(cè)定的結(jié)果進(jìn)一步升高。說明鄰苯二胺用量少時(shí)，體系中有雙乙酰未參加反應(yīng)；隨著鄰苯二胺用量不斷增大，更多的雙乙酰參加了反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不斷升高。

5 結(jié)論及展望

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，由于雙乙酰和鄰苯二胺的反應(yīng)會(huì)生成水，而 4mol/L鹽酸中大部分是水，因而用 4mol/L鹽酸作為反應(yīng)溶劑，在一定程度上會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行。用無水乙醇作為反應(yīng)溶劑，雙乙酰和鄰苯二胺的反應(yīng)會(huì)更為徹底。在后面進(jìn)行的鄰苯二胺濃度及用量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，隨著鄰苯二胺濃度和用量的提高，測(cè)得的雙乙酰數(shù)值也在上升。可以預(yù)見當(dāng)鄰苯二胺的用量進(jìn)一步提高時(shí)，雙乙酰的含量還會(huì)進(jìn)一步上升。但由于 25mL以上的比色管沒有 10mL刻度，如用移液管、移液槍等設(shè)備，其精密度較高，而比色管的精密度比較低，為了避免精密度原因?qū)е陆Y(jié)果的偏差，就沒有進(jìn)一步加大鄰苯二胺的用量。

使用飽和鄰苯二胺乙醇溶液 0.5mL、2.5mL和定容至 25mL，鄰苯二胺的用量比為 1∶5∶30，在最后一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比 3種用量的檢測(cè)結(jié)果可知，雙乙酰含量的增加倍數(shù)低于鄰苯二胺的用量的增加倍數(shù)。這可能是因?yàn)槠【浦械碾p乙酰含量有一個(gè)“極限”值，當(dāng)鄰苯二胺的用量達(dá)到某個(gè)數(shù)值時(shí)，即使用量再增加，雙乙酰的含量也基本不變了，這個(gè)數(shù)值可以看成是啤酒蒸出餾分中，雙乙酰的“真實(shí)”含量。

國標(biāo) GB/T 4928—2008對(duì)雙乙酰的檢測(cè)是通過雙乙酰和鄰苯二胺反應(yīng)，檢測(cè)其產(chǎn)物 2，3-二甲基喹喔啉的吸光度，因?yàn)猷高惢衔锏暮铣捎卸喾N方法，為了確保檢測(cè)過程中兩者能夠完全反應(yīng)，我們專門查閱了用聯(lián)二酮類和鄰苯二胺類合成喹喔啉類化合物相關(guān)的文獻(xiàn)：

龔寧等[10]的合成方法是以乙醇為溶劑，回流(約80℃)反應(yīng)2h可以反應(yīng)完全。

王東方等[11]、高文濤等[12]合成了一系列不同取代的喹喔啉類化合物，均是以乙酸為溶劑，回流(約120℃)反應(yīng)并隨時(shí)監(jiān)控，直到反應(yīng)完全。這也符合一般化學(xué)反應(yīng)的規(guī)律，即在反應(yīng)未達(dá)到平衡時(shí)，延長反應(yīng)時(shí)間可使反應(yīng)進(jìn)行得更為徹底，提高反應(yīng)溫度有利于提高反應(yīng)速度。

高文濤等[12]對(duì)喹喔啉類化合物的合成進(jìn)行了工藝改進(jìn)研究，將反應(yīng)溶劑乙酸改成了水，但在該反應(yīng)體系中，原料不溶于水，需要加入相轉(zhuǎn)移催化劑才能反應(yīng)，其產(chǎn)物也不溶于水，相當(dāng)于及時(shí)將產(chǎn)物移出反應(yīng)體系，也會(huì)促進(jìn)反應(yīng)正向進(jìn)行。而在雙乙酰和鄰苯二胺的反應(yīng)過程中，所有物料均能溶于反應(yīng)體系，和上述文獻(xiàn)中的情況不同。因此，上述文獻(xiàn)中的這個(gè)反應(yīng)條件對(duì)于雙乙酰的檢測(cè)中反應(yīng)條件的確定幾乎沒有參考意義。

基于該反應(yīng)生成水，李廷希等[13]的合成方法是將聯(lián)二酮與鄰苯二胺溶于正丁醇，因正丁醇和水不互溶，可以進(jìn)行回流分水，這樣才能使反應(yīng)進(jìn)行完全，這也符合該反應(yīng)的平衡移動(dòng)條件。

以上文獻(xiàn)中的反應(yīng)條件均是高溫或者長時(shí)間反應(yīng)。也有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，餾出液在接觸空氣的條件下，隨著放置時(shí)間的延長，或者放置溫度的提高，其中的雙乙酰前驅(qū)物 α-乙酰乳酸均會(huì)轉(zhuǎn)化為雙乙酰，使檢測(cè)結(jié)果變大；國標(biāo)GB/T 4928—2008中也提到，在蒸餾(高溫)過程中部分前驅(qū)體會(huì)轉(zhuǎn)化為聯(lián)二酮[5]，兩者相互印證。因此本文沒有對(duì)高溫及延長時(shí)間這 2個(gè)條件進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

在國標(biāo)GB/T 4928—2008的附錄C.9中，有氣相色譜法檢測(cè)雙乙酰，但該方法只能檢測(cè)雙乙酰和2，3-戊二酮，蒸餾法則可以檢測(cè)聯(lián)二酮類化合物及部分前驅(qū)體，因此2種方法的檢測(cè)結(jié)果無法互相參考或印證。