納米絲素纖維敷料對(duì)SD大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合影響與機(jī)制的研究

劉寧 陳華 沙娜 單愛軍 劉海華

燒傷（burns）是急診外科常見的創(chuàng)傷之一，發(fā)病率居外科創(chuàng)傷的第四位［1］。隨著工業(yè)的發(fā)展以及人口數(shù)量的增多，燒傷的病人隨之增多，特別是大面積深度燒傷。目前臨床處理大面積燒傷創(chuàng)面主要是運(yùn)用燒傷敷料覆蓋創(chuàng)面，但其易致細(xì)菌耐藥性，引起創(chuàng)面疼痛，抑制創(chuàng)面愈合，損傷正常組織等［2-4］。納米絲素纖維敷料是采用靜電紡織技術(shù)構(gòu)建的一種能夠保持創(chuàng)面濕潤(rùn)，防止摩擦和感染，提供良好愈合環(huán)境的覆蓋物。本研究通過分析納米絲素纖維敷料對(duì)SD 大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的影響及其機(jī)制研究，旨在為深度燒傷的臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康SPF 級(jí)SD 雄性大鼠60 只，大鼠周齡為8 周齡，體重180-250g，平均（206.57±18.35）g，購(gòu)于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，大鼠購(gòu)回后放入干凈的籠子，室溫控制在20℃左右，相對(duì)濕度控制在60%左右，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料和飲用水，保持飼養(yǎng)環(huán)境干凈衛(wèi)生，所有大鼠均經(jīng)1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察健康狀況良好后用于實(shí)驗(yàn)。每只大鼠背部建立深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，并隨機(jī)均分為納米絲素纖維輔料組、納米銀輔料組與空白組，每組20 只。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)深圳市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑與敷料蘇木素-伊紅染液購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；DAB 顯色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司、鹽酸氨水無水乙醇二甲苯中性樹膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EGF 抗體及CK10 抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，型號(hào)Eclipse CI）；熒光倒置顯微鏡（MSHOT，型號(hào)MF53）；納米絲素纖維敷料由西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供；納米銀敷料購(gòu)自安信生物科技有限公司。

1.3 模型建立取SD 大鼠，10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后背部備皮，完全刮干凈毛發(fā)，用苯扎溴銨消毒背部皮膚；把砝碼放到電磁爐水浴中燒開至沸騰，沸騰10 min，用鑷子把水浴中的砝碼夾到大鼠背部皮膚上，垂直置于要燙傷的部位，持續(xù)10 s，立即移開砝碼，建立直徑約2 cm 的燙傷創(chuàng)面（經(jīng)燙傷組織病理切片證實(shí)為深Ⅱ度燙傷），移開砝碼后用干毛巾擦干，立即予林格氏液5ml 腹腔注射抗休克治療，大鼠蘇醒后正常進(jìn)食水，表明建模成功。

1.4 創(chuàng)面?zhèn)谔幚硪约叭〔臓C傷模型建立后，定時(shí)觀察以及拍照，創(chuàng)面每日換藥，納米絲素纖維敷料組換藥消毒后外敷絲素纖維敷料，納米銀輔料組換藥消毒后外敷納米銀，空白組創(chuàng)面生理鹽水清洗，不作其他處理，所有創(chuàng)面均干潔紗布包扎，避免污染創(chuàng)面造成感染，所有大鼠分籠單獨(dú)喂養(yǎng)，每次換藥前均拍照。取5 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，分別是燙傷后第1、3、7、14、21 天，麻醉狀態(tài)下取材，每組隨機(jī)各處死4 只，切取創(chuàng)面至淺筋膜層。

1.5 創(chuàng)面愈合分析分別于燙傷后第1、3、7、14、21 天測(cè)量燙傷面積，燙傷面積的計(jì)算應(yīng)用Meeh's公式計(jì)算大鼠的體表面積（Acm2）=K×W2/3，W 體重（g），K=1O。燙傷部位體表面積即橢園形面積，（B）=π×r1×r2 cm（r1 為短軸半徑，r2為長(zhǎng)軸半徑）。實(shí)際的燙傷面積=B÷A。按照損傷剩余面積計(jì)算創(chuàng)面愈合率=（損傷總面積-創(chuàng)面剩余面積）÷總面積×100%。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色以及免疫組化所有按時(shí)間節(jié)點(diǎn)切取的組織做石蠟包埋及切片，進(jìn)行HE 染色鏡下觀察創(chuàng)面愈合情況；石蠟切片經(jīng)過脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、加一抗二抗、DAB 顯色、復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，圖像分析使用美國(guó)Media Cybernetics 公司生產(chǎn)的Image-ProPlus 圖像分析軟件，并高倍鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野觀察EGF、CK10 的平均光密度，并取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)處理，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組創(chuàng)面大體觀比較燙傷后第1 天，各組燙傷創(chuàng)面呈白色，表面皮膚組織水腫；第3 天燙傷處創(chuàng)面可見部分紫黑瘀斑樣改變，肉眼觀察愈合程度差別不明顯；第7 天，納米絲素纖維敷料組大鼠傷口周圍稍紅潤(rùn)，已形成焦痂，較軟，無明顯滲出，納米銀敷料組與空白組傷口焦痂較干燥且質(zhì)地較硬；第14 天，納米絲素纖維敷料組創(chuàng)面明顯變小，焦痂周圍開始軟化溶解，創(chuàng)周皮膚紅潤(rùn)，可見痂下愈合，部分焦痂脫落，納米銀敷料組與空白組創(chuàng)面愈合一般，未見明顯痂下愈合改變；第21天，納米絲素纖維敷料組創(chuàng)面基本愈合，焦痂完全脫落，可見新鮮皮膚組織，且已長(zhǎng)出毛發(fā)，較周圍正常皮膚紅潤(rùn)，納米銀敷料組與空白組創(chuàng)面仍有少許焦痂未脫落；典型愈合過程見圖1。

2.2 三組不同時(shí)點(diǎn)的創(chuàng)面愈合率比較第1 天和第3 天各組愈合率無明顯差別（P＞0.05），見表1。

2.3 三組創(chuàng)面組織HE 染色比較燙傷后第1、3天各組創(chuàng)面組織HE 染色顯示無明顯差別，第7 天納米絲素纖維敷料組創(chuàng)面組織中可見大量炎性細(xì)胞，纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管數(shù)量增多；納米銀敷料組與空白組中以可見炎性細(xì)胞、纖維細(xì)胞以及新生毛細(xì)血管，但較納米絲素纖維敷料組不明顯；第14 天納米絲素纖維敷料組創(chuàng)面大部愈合，可見組織內(nèi)表皮排列整齊，新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多且排列整齊，可見正常的毛囊皮脂腺結(jié)構(gòu)，納米銀敷料組和空白組創(chuàng)面見部分愈合，表皮毛細(xì)血管排列整齊，但正常毛囊皮脂腺結(jié)構(gòu)稍少見；第21天納米絲素纖維敷料組與納米銀敷料組創(chuàng)面基本愈合，基本接近正常皮膚組織，空白組創(chuàng)面組織中可見少許炎性細(xì)胞，典型結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 三組創(chuàng)面愈合大體觀

表1 三組燙傷后第7、14、21 天的創(chuàng)面愈合率比較（n=20，±s，%）

表1 三組燙傷后第7、14、21 天的創(chuàng)面愈合率比較（n=20，±s，%）

注：與同一時(shí)間點(diǎn)的空白組比較，*P＜0.05。

組別納米絲素纖維敷料組納米銀敷料組空白組7 天30.5±7.31*29.4±7.61*21.36±9.34 14 天72.23±5.26*71.84±7.25*44.29±12.62 21 天94.79±5.37*93.78±5.47*79.54±9.36

2.4 三組免疫組化結(jié)果比較各組創(chuàng)面組織通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)指標(biāo)EGF、CK10，染色結(jié)果均有陽(yáng)性顯示，但納米絲素纖維敷料組創(chuàng)面組織內(nèi)細(xì)胞分布最多（見圖3），EGF、CK10 平均光密度值比較，納米絲素纖維敷料組＞納米銀敷料組以及空白組，P＜0.05（見表2）。

3 討 論

皮膚組織燒傷創(chuàng)面的修復(fù)是一個(gè)由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的、復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要分為炎癥反應(yīng)期、新生組織形成期、組織重塑期。每一個(gè)階段都有細(xì)胞因子的參與，而創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞的生長(zhǎng)以及活性受各種生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。

3.1 EGF 與CK10 在創(chuàng)面修復(fù)中的作用研究表明EGF 參與創(chuàng)面修復(fù)的整個(gè)過程［5］，EGF 與其受體結(jié)合，能進(jìn)一步激活多種蛋白，促使表皮細(xì)胞分裂和增殖，刺激肉芽組織形成，提高膠原蛋白含量，增加基質(zhì)形成和加強(qiáng)結(jié)締組織收縮。表皮干細(xì)胞具有強(qiáng)大的分化增值能力，它在皮膚組織受創(chuàng)傷時(shí)被激活，并逐步分化為表皮及皮膚附屬器等組織結(jié)構(gòu)，最終實(shí)現(xiàn)缺損皮膚的再生修復(fù)，在創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［6，7］。研究顯示，表皮干細(xì)胞所處的外界環(huán)境對(duì)其增值分化影響巨大，而CK10 是表皮細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)記分子之一，其表達(dá)水平的差異可體現(xiàn)創(chuàng)面的修復(fù)水平［8-10］。

圖2 第21 天三組創(chuàng)面組織HE 染色

圖3 第21 天各組組織中創(chuàng)面EGF、CK19 免疫組化染色結(jié)果典型圖

表2 三組治療后第7 天、14 天、21 天ECF 和CK10 比較（n=20，±s）

注：與同時(shí)點(diǎn)的空白組比較，*P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)的納米銀敷料組比較，#P＜0.01。

組別納米絲素纖維敷料組納米銀敷料組空白組第7 天EGF 0.32±0.031*0.21±0.028*0.1±0.012第7 天CK10 0.38±0.041*0.23±0.029*0.17±0.034第14 天EGF 0.47±0.019*0.34±0.071*0.25±0.029第14 天CK10 0.5±0.056*0.43±0.037*0.3±0.022第21 天EGF 0.72±0.045*0.57±0.062*0.45±0.026第21 天CK10 0.81±0.067*#0.62±0.041*0.51±0.057

3.2 納米絲素纖維敷料在創(chuàng)面修復(fù)中的作用納米絲素纖維敷料是采用靜電紡織技術(shù)所構(gòu)建出來的敷料，它具有高孔隙率和較大的相對(duì)表面積，且載藥量大、釋放效率高，對(duì)生長(zhǎng)因子有良好的緩釋作用，亦能給生長(zhǎng)因子以及表皮干細(xì)胞提供良好的環(huán)境，進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)傷組織的修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，燙傷后第1、3 天納米絲素纖維敷料組、納米銀敷料組和空白組的HE 染色創(chuàng)面、EGF、CK10 的表達(dá)水平均無明顯差異，P均＞0.05；而第7、14、21 天的HE 染色創(chuàng)面顯示納米絲素纖維敷料組鏡下愈合程度較納米銀敷料組、空白組明顯加快，EGF、CK10 的表達(dá)水平納米絲素纖維敷料組＞納米銀敷料組＞空白組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P均＜0.05。提示納米絲素纖維敷料能有效促進(jìn)EGF 以及CK10 的表達(dá)從而促進(jìn)組織愈合。

綜上所述，納米絲素纖維敷料能有效促進(jìn)EGF 和CK10 的表達(dá)而促進(jìn)皮膚燒傷組織愈合，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。