美容功效顯著膠原蛋白肽固體飲料前景廣泛

張璐 劉京 張勝楠 李錦 郭曉玉 劉曉龍

人體皮膚組織富含50%以上的膠原蛋白，以膠原纖維和彈力纖維的形式維持著皮膚的基本結(jié)構(gòu)，對(duì)皮膚的水潤(rùn)、彈性和質(zhì)地起著非常重要的作用。但隨著年齡增長(zhǎng)，人體內(nèi)膠原蛋白會(huì)逐漸大量流失，是導(dǎo)致皮膚衰老最主要的原因。而皮膚衰老會(huì)導(dǎo)致肌膚暗沉、干涸等，因此需要不斷補(bǔ)充膠原蛋白才可以保持皮膚年輕。

來(lái)源于魚類的膠原蛋白及其水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與人體皮膚上的膠原結(jié)構(gòu)類似，同時(shí)又富含氨基酸及大量羥基，天生就是作為美容的基礎(chǔ)。膠原蛋白肽是分子量比膠原更小的蛋白質(zhì)，有較強(qiáng)的消化吸收性，因此有利于人體小腸的消化與吸收。

本文考察的固體飲料是以魚膠原蛋白肽粉為主要原料，聯(lián)合紅石榴果汁粉和酵母抽提物而組成，并采用野生型AB品系斑馬魚探究此固體飲料對(duì)皮膚彈性、補(bǔ)水保濕及美白作用的功效性評(píng)價(jià)。

一、材料與試劑

1.固體飲料配料。魚膠原蛋白肽粉83.33%，紅石榴果汁粉15%，酵母抽提物1.67%。用養(yǎng)魚用水將固體飲料配制成2mg/mL母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。野生型AB品系斑馬魚，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組30尾；黑色素等位基因突變半透明AL品系斑馬魚，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組30尾。

3.主要儀器。解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan），顯微鏡相連相機(jī)（VertA1，上海土森視覺科技有限公司，中國(guó)）；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo，America）；普通PCR擴(kuò)增儀（T100，Bio-rad，Singapore）；熒光定量PCR儀（CFX Connect，Bio-rad，Singapore）；精密電子天平（CP214，OHAUS，China）；6孔板（Fisher scientific，China）；低位裙邊96孔板（透明）（HSP9601，Bio-rad，America）；光學(xué)粘性封膜B（MSB1001，Bio-rad，America）。

4 .主要試劑。異丙醇（貨號(hào)A507048，上海生工）；氯仿（貨號(hào)T130144，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)SHBH6853，Sigma）；無(wú)水乙醇（批號(hào)2 0 1 8 1 2 1 0，昆山金誠(chéng)試劑有限公司）；甲基纖維素（批號(hào)079K0054V，Sigma，USA）；iTaq Universal SYBR Green Supermix（1725121，Bio-rad，America）；FastQuant RT Kit （With gDNase）試劑盒（貨號(hào)KR106，天根）；TRI reagent（貨號(hào)1382739，nvitrogen）；Bradford 1x Dye Reagent（#500-0205，BIO-RAD，USA）；Bovine Serum Albumin（BSA）Standard（#500-0206，BIO-RAD，USA）；RIPA裂解液（P0013B，Beyotime）；100 mM PMSF（ST506-2，Beyotime），L-左旋多巴（I1705022，阿拉?。?；氯化鈉（批號(hào)20180803，上海滬試）；熊果苷（批號(hào)35648，阿拉丁試劑（上海）有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.對(duì)皮膚彈性的影響。隨機(jī)選取360尾受精后5天的野生型AB系斑馬魚，置于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚；分別水溶給予膠原蛋白肽固體飲料222、667和2000μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，每孔容量為3mL，平行設(shè)置3次實(shí)驗(yàn)。供試品處理結(jié)束后，使用經(jīng)典Trizol法提取各組斑馬魚總RNA，通過q-PCR檢測(cè)目的基因col1a1b的轉(zhuǎn)錄水平；用β-actin作為基因表達(dá)的內(nèi)參，計(jì)算目的基因的RNA相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式如下：

用方差分析和Dunnetts T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異。

2.補(bǔ)水保濕作用。隨機(jī)選取150尾受精后2天的黑色素等位基因突變半透明AL品系斑馬魚，置于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚；水溶給予氯化鈉，建立斑馬魚微滲缺水模型；分別水溶給予膠原蛋白肽固體飲料222、667和2000μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每孔容量為3mL。供試品處理結(jié)束后，每組隨機(jī)取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并保存圖片，用NIS-Elements D 3.10高級(jí)圖像處理軟件對(duì)斑馬魚尾部面積（A）進(jìn)行分析，以尾部面積的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)膠原蛋白肽固體飲料對(duì)微滲缺水斑馬魚的補(bǔ)水保濕作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示。補(bǔ)水保濕作用計(jì)算公式如下：

采用方差分析和Dunnetts T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有顯著性差異。

3.美白作用。隨機(jī)選取150尾受精后6小時(shí)的野生型AB品系斑馬魚，置于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚；分別水溶給予膠原蛋白肽固體飲料222.2、666.7和2000μg/mL濃度，陽(yáng)性對(duì)照藥熊果苷3000μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每孔容量為3mL。各實(shí)驗(yàn)組處理48小時(shí)后，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用Image J圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析并采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚頭部黑色素光密度總和，以黑色素光密度總和的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)供試品對(duì)斑馬魚的美白作用。

4.對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用。隨機(jī)選取450尾受精后6小時(shí)的野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚，水溶給予膠原蛋白肽固體飲料222.2、666.7和2000μg/mL濃度，陽(yáng)性對(duì)照藥熊果苷3000μg/mL濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每個(gè)組別平行設(shè)置三組，每孔容量為3mL。各實(shí)驗(yàn)組處理48小時(shí)后，采用多巴胺氧化法，在475nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每一組別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以吸光度值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)供試品對(duì)斑馬魚酪氨酸酶活性的抑制作用。

三、結(jié)果

1.對(duì)皮膚彈性的影響

由表1可見，供試品處理斑馬魚后，與正常對(duì)照組比較，各劑量組均可增加皮膚彈性col1a1b基因相對(duì)表達(dá)量，有顯著性差異（p<0.01），即膠原蛋白肽固體飲料增加皮膚彈性作用顯著。

2.補(bǔ)水保濕作用

由表2可見，供試品處理斑馬魚后，與模型對(duì)照組比較，各劑量組均可增大斑馬魚的尾部面積，即膠原蛋白肽固體飲料具有一定的補(bǔ)水保濕作用。

3.美白作用

由圖1和表3可見，供試品處理斑馬魚后，與正常對(duì)照組比較，各劑量組均降低黑色素光密度總和，有顯著性差異（p<0.001），即膠原蛋白肽固體飲料具有明顯的美白作用。

4.對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

由表4可見，供試品處理斑馬魚后，與正常對(duì)照組比較，各劑量組均可降低酪氨酸酶的活性，有顯著性差異（p<0.001），即膠原蛋白肽固體飲料對(duì)酪氨酸酶具有明顯的抑制作用。

四、討論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本研究中的固體飲料增加皮膚彈性作用顯著，具有一定的補(bǔ)水保濕作用，具有明顯的美白作用，對(duì)酪氨酸酶活性也具有明顯的抑制作用。

本研究中的固體飲料是以魚膠原蛋白肽粉為主要原料，聯(lián)合紅石榴果汁粉和酵母抽提物組成。膠原蛋白肽屬于小分子，更容易被吸收，可直接為機(jī)體補(bǔ)充所損失的膠原蛋白，而膠原蛋白所特有的三螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)真皮組織起到支撐作用，具有鎖水保濕、防皺緊膚、營(yíng)養(yǎng)美白等功效。石榴味甘酸、澀溫，能夠有效的抗氧化，延緩衰老。酵母提取物作為天然安全的活性物在食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用，比如用作天然調(diào)味料或者油類食品的抗氧化劑，在化妝品中也可以發(fā)揮其獨(dú)特的功效。Gaspar等通過人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了酵母提取物具有可以媲美維生素的安全性，具有顯著改善皮膚狀況的功效，包括改善皮膚粗糙度等，同時(shí)受試者自我評(píng)分結(jié)果顯示，酵母提取物有良好的亮白皮膚的功效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究報(bào)道相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了膠原蛋白肽固體飲料的美容功效，且口服安全，故具有廣泛的應(yīng)用前景。