短小芽孢桿菌W-7 與甲霜靈錳鋅對(duì)致病疫霉的 協(xié)同抑制作用

梁 嬌，張聰穎，喬 柳，孟翠麗，蔣繼志

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2. 邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北 邢臺(tái) 054000）

由卵菌致病疫霉(Phytophthora infestans) 引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最為主要的病害，當(dāng)前控制馬鈴薯晚疫病的方法主要有抗病育種、農(nóng)業(yè)栽培及化學(xué)防治，其中化學(xué)防治見效最快，以雙炔酰菌胺和甲霜靈等制劑的應(yīng)用較為普遍。但隨著農(nóng)藥長(zhǎng)期過量使用，致病疫霉抗藥性不斷增強(qiáng)［1］，高抗菌株出現(xiàn)頻率逐年增加，甚至在部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)高抗菌株已達(dá)到了100%，同時(shí)甲霜靈及其衍生制劑對(duì)環(huán)境、甚至對(duì)人類健康也帶來了一定的危害［2］。 因此，如何既能減少甲霜靈等化學(xué)農(nóng)藥的用量又能促使馬鈴薯增產(chǎn)并提高產(chǎn)品質(zhì)量，是當(dāng)前馬鈴薯生產(chǎn)中受到格外關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。已報(bào)道的一些研究結(jié)果表明，添加農(nóng)藥控失劑［3］、利用拮抗菌及其制劑［4］、將不同農(nóng)藥復(fù)配［5］、拮抗菌與根際微生物復(fù)配［6］、將不同拮抗菌復(fù)配［7］在抑制致病疫霉或溫室、甚至田間防治馬鈴薯晚疫病均有一定的效果。此外，將生防菌與化學(xué)藥劑按一定比例混合后防治黃瓜根結(jié)線蟲病、辣椒疫病和蔬菜苗期立枯病等病害，均可顯著減少農(nóng)藥的用量［8-10］。但迄今未見將生防菌與化學(xué)藥劑按一定比例混合后抑制致病疫霉或防治馬鈴薯晚疫病的報(bào)道。本試驗(yàn)是在本研究室前期已連續(xù)10 年監(jiān)測(cè)我國(guó)北方5 省區(qū)致病疫霉對(duì)甲霜靈抗性［11］及篩選獲得了多株對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)和產(chǎn)孢有顯著抑制作用的拮抗菌株的基礎(chǔ)上［12-13］， 選擇其中抑菌作用強(qiáng)（抑菌率為94.44%）、離體防病效果顯著（防效為73.40%）、與其它拮抗菌配伍后能顯著增加抑菌和防病效果的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）W-7［7，13］與馬鈴薯生產(chǎn)中使用頻率較高的甲霜靈錳鋅復(fù)配，探討兩者復(fù)配后對(duì)致病疫霉的協(xié)同抑制效果，為田間減少農(nóng)藥使用的同時(shí)更加高效地防治馬鈴薯晚疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料和培養(yǎng)基

供試菌株：致病疫霉［Phytophthora infestans(Mont.) de Bary］ W101，為本研究室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株，黑暗保存在14 ℃培養(yǎng)箱；短小芽孢桿菌［Bacillus pumilus(Meyer and Gottheil)］ W-7，為本實(shí)驗(yàn)室采自黑龍江省訥河市田間馬鈴薯晚疫病病葉上分離純化并鑒定，保存于4 ℃培養(yǎng)箱；馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它，購(gòu)自保定市工農(nóng)路果品批發(fā)市場(chǎng)。供試培養(yǎng)基為黑麥培養(yǎng)基（Rye）、LB 固體培養(yǎng)基（LB）及LB 液體培養(yǎng)基（LBL）。

1.2 甲霜靈錳鋅與W-7 菌株的復(fù)配

以少量二甲基亞楓溶解含量為98%的甲霜靈錳鋅原藥為原液（廣州植物龍生物技術(shù)有限公司），再以無菌水稀釋成濃度分別為40、70、100、150、200 μg/mL 的藥液；根據(jù)萬安琪［13］的方法制備W-7菌株原液（1.85×108cfu/mL）；參考楊秀榮等［10］的方法檢測(cè)甲霜靈錳鋅與W-7 菌株復(fù)配的可行性，并做如下修改：在26 mL LBL 中分別加入1 mL W-7菌株原液和3 mL 不同濃度（40、70、100、150、200 μg/mL）的甲霜靈錳鋅藥液，使培養(yǎng)液中甲霜靈錳鋅的終濃度分別為4、7、10、15、20 μg/mL，28 ℃振蕩培養(yǎng)（120 r/min）48 h，以W-7 菌株原液?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)48 h 為對(duì)照，培養(yǎng)液用無菌水稀釋106倍后分別在LB 上涂布培養(yǎng)48 h 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.3 甲霜靈錳鋅與W-7 不同體積比復(fù)配后抑制致病疫霉菌絲效果的測(cè)定

根據(jù)上述1.2 的結(jié)果，選擇對(duì)W-7 菌株生長(zhǎng)沒有明顯影響的最高甲霜靈錳鋅濃度（15 μg/mL）與 W-7菌液原液以不同體積比復(fù)配，使其體積比為3∶1、 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，采用對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定復(fù)配液 對(duì)致病疫霉菌絲的抑制作用，在致病疫霉菌餅兩側(cè)打孔，孔中分別加入上述不同復(fù)配液30 μL，以加入等體積單獨(dú)振蕩培養(yǎng)48 h 的W-7 菌液原液為對(duì)照1，等體積15 μg/mL 的甲霜靈錳鋅藥液為對(duì)照2，等體積LBL 為空白對(duì)照。20 ℃培養(yǎng)7 d 后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，十字交叉法測(cè)量菌落直徑計(jì)算抑菌率，同時(shí)挑取致病疫霉菌落邊緣的菌絲在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)菌絲畸變率［12］。

1.4 甲霜靈錳鋅與W-7 不同體積比復(fù)配后抑制致病疫霉孢子囊效果的測(cè)定

將甲霜靈錳鋅與W-7 菌液原液不同體積比的復(fù)配液（體積比同1.3）與1 mL 致病疫霉孢子囊懸浮液按體積比1∶1 混合，以等體積W-7 菌液原液和甲霜靈錳鋅藥液（15 μg/mL）與孢子囊懸浮液混合分別作為對(duì)照1 和對(duì)照2，以等體積無菌水與孢子囊懸浮液混合作為空白對(duì)照。25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)32 h，鏡檢300 個(gè)孢子囊，統(tǒng)計(jì)孢子囊畸變率及直接萌發(fā)率。

1.5 甲霜靈錳鋅與W-7 復(fù)配液對(duì)馬鈴薯塊莖切片的防病作用

制備馬鈴薯塊莖切片（2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm），選擇1.4 中適宜的復(fù)配液稀釋20 倍后，取20 μL 均勻涂抹在切片表面上，2 d 后接種致病疫霉菌餅（直徑7 mm），以涂抹等體積W-7 菌液為對(duì)照1，等體積甲霜靈錳鋅藥液（15 μg/mL）為對(duì)照2，等體積LBL 為空白對(duì)照，對(duì)照組均稀釋20 倍，20 ℃黑暗保濕培養(yǎng)7 d，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)［14］。

以上試驗(yàn)每種處理設(shè)5 次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲霜靈錳鋅與W-7 菌株的復(fù)配

將培養(yǎng)液在LB 上涂布培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)培養(yǎng)W-7 菌株的對(duì)照菌落數(shù)為最多（185 cfu/mL），供試幾種甲霜靈錳鋅濃度下的菌落數(shù)均少于對(duì)照，其中以甲霜靈錳鋅濃度為20 μg/mL 時(shí)的菌落數(shù)最少（145 cfu/mL），與對(duì)照達(dá)到顯著性差異（P＜0.05），其它幾種濃度的處理均與對(duì)照無顯著性差異（圖1）。以上結(jié)果說明加入0 ～15 μg/mL 的甲霜靈錳鋅對(duì)W-7 菌體生長(zhǎng)基本無影響，但加入過高濃度的甲霜靈錳鋅對(duì)W-7 菌株的生長(zhǎng)有一定抑制作用。

圖1 不同濃度甲霜靈錳鋅對(duì)W-7 菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different concentrations of metalaxyl mancozeb on W-7 strain growth

2.2 甲霜靈錳鋅與W-7 不同體積比復(fù)配后對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

為了充分發(fā)揮甲霜靈錳鋅對(duì)病菌的抑制作用，選擇2.1 中對(duì)W-7 菌株生長(zhǎng)沒有顯著抑制作用的甲霜靈錳鋅最高濃度（15 μg/mL）與W-7 菌液原液按照不同體積比進(jìn)行復(fù)配，不同復(fù)配液對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用如圖2 所示，兩者體積比為1:2時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到98.94%，顯著優(yōu)于其他幾種復(fù)配液的抑制作用，尤其是與W-7 菌液?jiǎn)为?dú)處理的對(duì)照1（93.76%）之間達(dá)到顯著性差異（P＜0.05），與甲霜靈錳鋅單獨(dú)處理的對(duì)照2（3.26%）之間達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。兩者復(fù)配后對(duì)致病疫霉菌絲體生長(zhǎng)的抑制率高于兩者單獨(dú)處理的抑菌率之和，表明W-7 菌株與甲霜靈錳鋅復(fù)配后在抑制菌絲生長(zhǎng)方面發(fā)揮了增效作用。

圖2 甲霜靈錳鋅與W-7 菌液原液不同體積比復(fù)配對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volumes on mycelial growth of P. infestans

2.3 甲霜靈錳鋅與W-7 不同體積比復(fù)配后對(duì)致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響

挑取受甲霜靈錳鋅與W-7 復(fù)配液抑制的菌落邊緣的菌絲體（圖3），鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲體有彎曲、內(nèi)含物分布不均勻、內(nèi)含物外泄等畸變狀態(tài)，其中仍以霜靈錳鋅與W-7 以體積比為1:2 復(fù)配時(shí)的菌絲畸變率最高（48.56%），顯著高于其他復(fù)配處理 （P＜0.05），與W-7 菌液?jiǎn)为?dú)處理的對(duì)照1（33.23%）和甲霜靈錳鋅單獨(dú)處理的對(duì)照2（6.44%）之間均達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。兩者復(fù)配處理后所導(dǎo)致的菌絲畸變率明顯高于兩者單獨(dú)處理的畸變率之和，表明W-7 菌株與甲霜靈錳鋅復(fù)配后在菌絲致畸方面發(fā)揮了增效作用。

圖3 甲霜靈錳鋅與W-7 菌液原液不同體積比復(fù)配 對(duì)致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響Fig.3 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volumes on mycelial form of P. infestans

2.4 甲霜靈錳鋅與W-7 不同體積比復(fù)配后對(duì)致病疫霉孢子囊直接萌發(fā)的影響

將甲霜靈錳鋅與W-7 的復(fù)配液與致病疫霉孢子囊混合培養(yǎng)后，鏡檢發(fā)現(xiàn)孢子囊的直接萌發(fā)率均顯著低于空白對(duì)照（圖4），其中以體積比為1:1 進(jìn)行復(fù)配時(shí)孢子囊直接萌發(fā)率最低（5.87%），其次為體積比為1:2 的處理（6.32%），這2 種處理之間無顯著性差異，但這2 種處理均顯著低于W-7 單獨(dú)處理（9.12%），也顯著低于甲霜靈錳鋅藥液的單獨(dú)作用（14.24%）以及空白對(duì)照（23.51%）（P＜0.05）。兩者復(fù)配后的孢子囊萌發(fā)率大約為W-7 單獨(dú)處理的2/3，是甲霜靈錳鋅藥液?jiǎn)为?dú)處理的1/3，表明W-7菌株與甲霜靈錳鋅復(fù)配后在抑制孢子囊直接萌發(fā)方面發(fā)揮了協(xié)同作用。

圖4 甲霜靈錳鋅與W-7 菌液不同體積比復(fù)配對(duì) 致病疫霉孢子囊直接萌發(fā)的影響Fig.4 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volumes on sporangia direct germination of P. infestans

2.5 甲霜靈錳鋅與W-7 不同體積比復(fù)配后對(duì)致病疫霉孢子囊畸變的影響

甲霜靈錳鋅與W-7 的復(fù)配液不僅顯著降低致病疫霉孢子囊的直接萌發(fā)，且導(dǎo)致孢子囊的形態(tài)發(fā)生畸變（圖5），其中兩者以1∶1 體積比復(fù)配后導(dǎo)致的孢子囊畸變率最高（54.36%），其次為體積比為1∶2 的處理（53.88%），這2 種處理之間無顯著性差異，但這2 種處理均與W-7 單獨(dú)處理（40.94%）之間達(dá)到了顯著性差異（P＜0.05），尤其是與甲霜靈錳鋅單獨(dú)處理（18.39%）之間達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01）。兩者復(fù)配后所導(dǎo)致的孢子囊畸變率與兩者單獨(dú)處理的孢子囊畸變率之和十分相近，表明W-7 菌株與甲霜靈錳鋅復(fù)配后在引起孢子囊畸變方面發(fā)揮了協(xié)同作用。

圖5 甲霜靈錳鋅與W-7 菌液不同體積比復(fù)配對(duì)致病疫霉 孢子囊畸變的影響Fig.5 Effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain in different volume on sporangia deformation of P. infestans

2.6 甲霜靈錳鋅與W-7 復(fù)配在馬鈴薯塊莖切片上的協(xié)同防病作用

甲霜靈錳鋅與W-7 菌液原液復(fù)配液對(duì)晚疫病的防病效果如圖6 所示，LBL 對(duì)照及甲霜靈錳鋅對(duì)照切片表面菌絲體生長(zhǎng)旺盛，幾乎整個(gè)切片都被菌絲體覆蓋，且表面變色嚴(yán)重，切開可見大部分組織變色發(fā)黑；W-7 對(duì)照切片表面菌絲體稀疏，變色面積較小，切開后未變色；而涂抹復(fù)配液的切片表面幾乎無菌絲體，且變色面積較小，切開后也未見變色現(xiàn)象。復(fù)配液處理后的病情指數(shù)及防病效果與W-7、甲霜靈錳鋅單獨(dú)處理之間存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)配后的防效顯著高于兩者單獨(dú)處理后的防效之和，表明W-7 菌株與甲霜靈錳鋅復(fù)配后在馬鈴薯塊莖切片上發(fā)揮了協(xié)同增效作用。

圖6 甲霜靈錳鋅與W-7 菌液復(fù)配在塊莖切片上的防病效果Fig.6 Protection effect of compound of metalaxyl mancozeb with W-7 strain on potato tuber slices infected by P. infestans

3 討論

近年來，由于長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥防治馬鈴薯晚疫病，致病疫霉抗藥性逐年增加，加之農(nóng)藥對(duì)人體有一定危害，因此尋找如何在使用農(nóng)藥時(shí)達(dá)到減施增效的途徑或措施迫在眉睫。雖然目前已經(jīng)篩選獲得了許多能顯著抑制致病疫霉生長(zhǎng)及產(chǎn)孢，并且在離體組織和溫室中防病效果顯著的一些拮抗菌［3］，但拮抗菌田間防效還不穩(wěn)定，制約了其進(jìn)一步研究和開發(fā)利用［4］。楊秀榮等［10］研究表明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B579 與多菌靈復(fù)配后，對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到77.80%，顯著高于單獨(dú)施用生防菌（33.30%）或多菌靈（50.20%）的處理；孫雪瑩［15］報(bào)道生防菌枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和氟唑菌苯胺復(fù)配后，對(duì)番茄莖基腐病菌（R. solani）菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高為68.70%，高于菌懸液?jiǎn)蝿?6.30%）和藥劑單劑（63.33%）；段海明等［16］比較了生防菌解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）gfj-4 菌株的無菌體發(fā)酵液與咯菌腈、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、腈菌唑和福美雙6 種殺菌劑復(fù)配后對(duì)玉米莖腐病菌（Fusarium graminearum）的抑制作用，發(fā)現(xiàn)6 種殺菌劑分別與gfj-4 菌株發(fā)酵液復(fù)配后，對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)均有顯著的增效作用；Ji M 等［17］采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了枯草芽孢桿菌DJ-6 與吡唑醚菌酯及其5 種配比對(duì)草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的室內(nèi)抑制活性，結(jié)果顯示100 μL/mL 枯草芽孢桿菌和100 μg/mL 吡唑醚菌酯單獨(dú)處理后，病菌菌落直徑分別為35.75 和16.00 mm，抑菌率分別為36.92%和77.44%，當(dāng)兩者分別以1∶1、1∶2、1∶3 和1∶4 等不同體積比復(fù)配后，病菌菌落直徑均在10.00 mm 以下，抑菌率均在89%以上，兩者復(fù)配后表現(xiàn)出了顯著的增效作用。但迄今為止，將生防菌與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配后抑制致病疫霉并防治馬鈴薯晚疫病尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)探討了短小芽孢桿菌W-7 與甲霜靈錳鋅之間的復(fù)配及其在防治馬鈴薯晚疫病方面的潛力，發(fā)現(xiàn)將甲霜靈錳鋅藥液與W-7 菌液原液復(fù)配后，對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率均優(yōu)于各自單獨(dú)的處理，這與楊秀榮等［10］報(bào)道的枯草芽孢桿菌B579 與多菌靈復(fù)配抑制立枯絲核菌、孫雪瑩［15］進(jìn)行的枯草芽孢桿菌和氟唑菌苯胺復(fù)配抑制番茄莖基腐病菌、段海明等［16］研究的解淀粉芽孢桿菌gfj-4 菌株的無菌體發(fā)酵液與6 種殺菌劑復(fù)配后抑制玉米莖腐病菌的效果一致，生防菌與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配后對(duì)抑制病菌菌絲生長(zhǎng)均有顯著的增效作用，且本試驗(yàn)所得到的抑菌率均高于上述文獻(xiàn)報(bào)道。此外，本試驗(yàn)探討了W-7菌株菌液與甲霜靈錳鋅對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)及孢子囊萌發(fā)的影響，結(jié)果顯示W(wǎng)-7 菌液與甲霜靈錳鋅以1∶2 體積比復(fù)配后的抑菌率最高，達(dá)到98.94%，顯著高于兩者單獨(dú)處理的抑菌率之和，這與Ji M 等［17］研究報(bào)道的枯草芽孢桿菌DJ-6 與吡唑醚菌酯以不同體積配比后抑制草莓枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的效果也基本一致，該試驗(yàn)中除了枯草芽孢桿菌DJ-6 與吡唑醚菌酯以1∶5 的體積比復(fù)配后的抑菌率略低于吡唑醚菌酯單獨(dú)處理外，其它比例復(fù)配后的抑菌率均明顯高于兩者的單獨(dú)處理，但該試驗(yàn)中復(fù)配后的抑菌率與單獨(dú)處理之間的差異較小。除了將W-7 菌株菌液與甲霜靈錳鋅以不同體積配比抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)和孢子囊萌發(fā)外，本試驗(yàn)還測(cè)試了復(fù)配液在馬鈴薯塊莖切片上對(duì)晚疫病的預(yù)防效果，復(fù)配液處理后的防病效果（91.36%）顯著高于兩者單獨(dú)處理后的防效之和（30.47%），這一結(jié)果明顯優(yōu)于楊秀榮等［10］將枯草芽孢桿菌B579 與多菌靈混配后防治蔬菜苗期立枯病的防效（87.30%），也顯著優(yōu)于劉合昌等［9］將甲霜靈和芽孢桿菌（Bacillussp.）B702 進(jìn)行混配對(duì)盆栽辣椒疫病的防治效果（83.10%）。以上結(jié)果均表明，W-7 菌液與甲霜靈錳鋅復(fù)配后在抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)和離體組織預(yù)防晚疫病方面均表現(xiàn)出了顯著的協(xié)同或增效作用，顯著優(yōu)于兩者的單獨(dú)處理，甚至優(yōu)于兩者單獨(dú)處理之和，暗示將兩者復(fù)配在未來預(yù)防馬鈴薯晚疫病方面有較大的應(yīng)用潛力。但使用該復(fù)配液預(yù)防馬鈴薯晚疫病尚未進(jìn)行盆栽植株和大田試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)于復(fù)配液中的生防菌在馬鈴薯植株上的定殖動(dòng)態(tài)以及持效期也還不明確，這些問題均有待進(jìn)一步研究。