生物法拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈

張朝暉，張利坤，陸躍樂

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

生物法拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈

張朝暉，張利坤，陸躍樂

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

從土壤和污泥樣品中分離得到一株能不對稱水解甲霜靈的革蘭陰性菌。通過分子生物學(xué)鑒定，命名該菌株為Albibacterssp.zjut528。當?shù)孜餄舛葹?0 g·L-1，濕菌體（含水量81%）:底物=0.3:1（質(zhì)量比），反應(yīng)28 h，產(chǎn)物得率為47.1%，主產(chǎn)物為R-甲霜靈酸，對映體過量值eep> 99.9%。將菌株細胞破碎得到的粗酶液分離純化得到一個 SDS-PAGE 電泳純的酯酶，分子量約為 40×103，酶的N端10個氨基酸序列為NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。該酶最適溫度為40℃，20～40℃穩(wěn)定性較好。最適pH為9.0，在pH 5.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。Fe2+、Mn2+、Zn2+對酶活有促進作用，F(xiàn)e3+對酶活有一定的抑制作用。在含有20%的乙腈、異丙醇、丙酮、二異丙醚、環(huán)己烷、正己烷的水溶液中，酶活均比在純水相中有明顯提高。該酶反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程，Vm為 0.18 mmol·L-1·min-1，Km為 2.29 mmol·L-1，Kcat為 0.85 min-1。建立了一條利用Albibacterssp.zjut528細胞作催化劑拆分甲霜靈制備R-甲霜靈的工藝路線，終產(chǎn)品R-甲霜靈的純度是96.2%，ee值為99.3%。

生物催化；生物過程；水解；R,S-甲霜靈；R-甲霜靈；菌種篩選和鑒定；酯酶；Albibacters

引 言

近年來，手性農(nóng)藥在農(nóng)藥化學(xué)品中占據(jù)的比例越來越大[1-2]。手性農(nóng)藥的對映體具有相同的物理和化學(xué)性質(zhì)，但是生物特性方面卻可能有很大的差異，包括降解性、生物活性和毒性等方面[3-11]。光學(xué)純產(chǎn)品與外消旋產(chǎn)品相比，它的優(yōu)勢有：能提高單位產(chǎn)品的藥效，減少農(nóng)藥噴灑的總量，減少非活性異構(gòu)體的使用量（它可能對非靶標生物有副作用）。此外，光學(xué)純產(chǎn)品的使用量只有外消旋產(chǎn)品的50%，方便運輸和儲存。

甲霜靈，化學(xué)名稱R,S-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯，是一種高效低毒、內(nèi)吸性酰胺類殺菌劑，廣泛用于防治病原真菌中的卵菌綱(Oomycetes)病菌引起的疾病，對多種農(nóng)作物的霜霉病和疫霉病等有很強的治療效果[12-13]，還用于觀賞植物、樹木等的病害防治[14]。它是一種典型的旋光活性農(nóng)藥。研究表明，它的兩個對映體在到達受體或與受體結(jié)合方面表現(xiàn)出明顯差異[15]。甲霜靈活性主要來源于R-型，通常比S-型高很多[16-17]。對一些致病疫霉菌(Phythophthora infestans)和終極腐霉菌(Pythium ultimum)的體外實驗表明，R-型活性約是S-型的 1000倍，在體內(nèi)前者為后者的3～10倍[18]。甲霜靈對映體在土壤中的降解速度也不同。當土壤的 pH < 4時，S-甲霜靈降解速度比R-甲霜靈降解速度快，在 pH > 5的有氧條件下，R-甲霜靈的降解速度更快[12,19-20]。

目前，國內(nèi)生產(chǎn)的甲霜靈主要是外消旋甲霜靈，有數(shù)千噸的規(guī)模。國外生產(chǎn)的甲霜靈主要是精甲霜靈(R體為主)，國內(nèi)精甲的生產(chǎn)規(guī)模較小。幾乎所有的甲霜靈生產(chǎn)均采用化學(xué)法[21]。利用生物催化劑生產(chǎn)手性物質(zhì)，與用化學(xué)法生產(chǎn)相比，優(yōu)點是條件溫和、選擇性高和污染少。使用脂肪酶作催化劑進行生物拆分，已成為生產(chǎn)手性產(chǎn)品的重要方法之一[22]。

目前有一些用生物拆分法制備R-甲霜靈的研究報道，拆分對象是生產(chǎn)外消旋甲霜靈的中間體R,S-N-(2, 6-二甲基苯基)丙氨酸甲酯(MAP)，得到的R-MAP再按原來的方法合成R-甲霜靈。已報道的可對映體選擇性拆分 MAP的催化劑主要有：脂肪酶 Lipase PS (Burkhloderia cepacia)、Lipase OF、Lipase QLM[23]、Lipase CRL[24-25]、PSL[26-28]、CAL-B[27-28]等，堿性蛋白酶Alcalase以及?；D(zhuǎn)移酶Acylase Amano[23]等，微生物細胞Burkhloderiasp.MC16-3和99-2-1[29]。上述催化劑對MAP的立體選擇性有R型(如 Lipase PS)，也有S型[28]。其中用Lipase PS催化MAP水解得到的R-MAP的ee值大于 98%[23]。Park等[30]報道了一條用Lipase PS實驗室規(guī)模拆分MAP制備R-甲霜靈的工藝，終產(chǎn)品R-甲霜靈的ee值是96%。

本文將研究用生物法直接拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈。首先，利用以甲霜靈為唯一碳源的培養(yǎng)基，從土壤、污泥等樣品中篩選能選擇性水解甲霜靈的菌種，對其進行生物學(xué)鑒定；然后通過分離純化獲得胞內(nèi)的目標酯酶，對其酶學(xué)性質(zhì)進行研究；最后，利用菌體細胞作催化劑，建立一條生物法拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈的新工藝。

1 材料與方法

1.1 土壤等樣品

浙江、江蘇等地土壤和污泥樣品若干份。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

富集培養(yǎng)基(g·L-1)：K2HPO42.1，KH2PO40.4，NaCl 0.1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.025，NH4NO30.5，微量元素液1%(體積)，甲霜靈（不同富集階段加入不同量甲霜靈，使其最終在培養(yǎng)基終濃度為0.02、0.05、0.1、1 g·L-1)，121℃滅菌 20 min。

微量元素液(g·L-1)：CoCl20.1，MnSO40.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CuSO40.1，ZnSO4·7H2O 0.1，H3BO30.01，Al2(SO4)3·12H2O 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，EDTA·2Na 1，配制方法：取 1g EDTA·2Na溶于800 ml去離子水中，再將其他組分依次加入，最后加水至1 L。

固體培養(yǎng)基(g·L-1)：NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO41.0，NH4NO31.0，酵母浸出粉5.0，葡萄糖5.0，甲霜靈1，瓊脂20，115℃滅菌20 min。

復(fù) 篩 搖 瓶 培 養(yǎng) 基 (g·L-1)： NaCl 0.5 ，MgSO4·7H2O 1.0，K2HPO41.0，NH4NO31.0，酵母浸出粉5.0，葡萄糖5.0，甲霜靈1，115℃滅菌20 min。

復(fù)篩培養(yǎng)方法：將富集培養(yǎng)物涂布在固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～4 d后，挑取單菌落接入復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基中，30℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1培養(yǎng)，定期取樣分析。

菌株的16S rDNA 擴增和進化樹的構(gòu)建：用通用引物27F/1492R進行16S rDNA的PCR擴增：正向 5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′； 反 向5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

采用 MEGA 4.0軟件中的鄰近法(Neighbor-Joining)與1000次Bootstrap的統(tǒng)計檢驗構(gòu)建進化樹。

1.3 菌體細胞催化外消旋體甲霜靈不對稱水解的性能

催化反應(yīng)體系為100 ml，含外消旋甲霜靈5 g，濕菌體（含水量81%）1.5 g，異丙醇終濃度20%（體積），以磷酸緩沖液(pH=8.0)為反應(yīng)介質(zhì)，在 180 r·min-1，37℃下?lián)u瓶中反應(yīng)。

1.4 目標酯酶的分離純化

1.4.1 粗酶液的收集 將菌種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，180 r·min-1、30℃培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）洗滌 3 次，重懸于緩沖液，超聲破碎細胞，8000 r·min-1離心10 min，收集上清液得粗酶液。

1.4.2 粗酶液在離子交換柱層析前的預(yù)處理 將粗酶液在冰浴條件下攪拌，緩慢加入適量粉狀硫酸銨，4℃靜置6 h后，4000 r·min-1離心30 min，沉淀用100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)溶液溶解。 將溶解的酶液轉(zhuǎn)移到透析袋中，在10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液進行冰水浴透析，更換4～5次緩沖液，透析12 h。將透析后的酶液裝入15 ml截留分子量10×103的超濾離心管中，6000 r·min-1離心 30 min，截留粗酶液用適量 10 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液稀釋，用于離子交換層析。

1.4.3 陰離子交換層析 以 DEAE Sepharose Fast Flow層析柱進行蛋白分離，先用平衡緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)以 1 ml·min-1流速沖洗柱子，柱子平衡后，用0.22 μm濾頭對樣品過濾后上樣。用含不同濃度 NaCl的洗脫緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)進行梯度洗脫，流速 1 ml·min-1，收集洗脫峰，檢測各個峰的酶活，將有活性的酶液進行超濾濃縮后，用于凝膠過濾層析。

1.4.4 凝膠過濾層析 采用SephadexG75為填料，先用緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)平衡凝膠柱，流速為 1 ml·min-1。將樣品經(jīng) 0.22 μm 濾頭過濾后，以柱體積的2%進行上樣。以1 ml·min-1的流速用緩沖溶液洗脫1.5倍柱體積直到基線平穩(wěn)，收集不同洗脫體積下的洗脫峰，檢測各個峰的酶活。

1.5 酶動力學(xué)測定

在37℃、pH 8.0條件下測定酶液在不同甲霜靈底物濃度下的反應(yīng)速度，加入20%異丙醇作助溶劑。

1.6 拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈的工藝

1.6.1 細胞催化甲霜靈不對稱水解 將菌株Albibactersp.zjut528接種于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，離心保留菌體，用200 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗滌3次。水解反應(yīng)體系同1.3節(jié)。

將反應(yīng)后的反應(yīng)液用氨水調(diào)節(jié)至pH約9.0，乙酸乙酯萃取，有機相加無水硫酸鎂除水，過濾后旋蒸，得到S-甲霜靈。萃余水相用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0左右，再用乙酸乙酯萃取，有機相加入無水硫酸鎂除水，過濾后旋蒸得到R-甲霜靈酸。

1.6.2R-甲霜靈酸與甲醇反應(yīng)制備R-甲霜靈 取1.6.1節(jié)制得的R-甲霜靈酸，溶于無水甲醇中，冰浴滴加二氯亞砜（1.1倍于R-甲霜靈酸物質(zhì)的量），滴加完畢后冰浴反應(yīng)10 min，然后回流反應(yīng)4 h，旋蒸濃縮。將旋蒸后的產(chǎn)物溶于乙酸乙酯，用5%Na2CO3溶液洗滌2次，去離子水洗滌1次。有機相加入無水硫酸鎂除水，過濾后旋蒸，得到R-甲霜靈。

1.6.3S-甲霜靈的消旋化 取適量由 1.6.1節(jié)得到的S-甲霜靈溶于無水乙腈，加入消旋催化劑，在30、40、50、60℃下反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后旋蒸乙腈，用HCl(0.1mol·L-1)溶液洗滌旋蒸后的產(chǎn)物，乙酸乙酯萃取，有機相加入無水硫酸鎂除水，過濾后旋蒸，即得消旋產(chǎn)物。

1.7 分析方法

1.7.1 甲霜靈和甲霜靈酸的HPLC分析 根據(jù)文獻[31]進行了改進。樣品預(yù)處理：取一定量水解反應(yīng)液加HCl至pH為4左右，乙酸乙酯萃取，取一定量有機相，氮氣吹干，加入流動相溶解。流動相組成是正己烷:異丙醇:三氟乙酸=80:20:0.1，流速 0.8 ml·min-1，檢測波長 230 nm，柱溫 30℃，大賽璐（Daicel）手性O(shè)D柱250 mm × 4 mm。

產(chǎn)物對映體過量值 (eep) 和產(chǎn)物收率C按下式計算

式中，[P]S和[P]R分別為樣品中S和R型產(chǎn)物的含量，eep為產(chǎn)物的對映體過量值，CP為產(chǎn)物的濃度，CS為底物的濃度。

1.7.2 酯酶活力測定 取適量酶液，加到含1 g·L-1甲霜靈的 100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液中，反應(yīng)體系5 ml，37℃反應(yīng)10 min，強酸終止反應(yīng)，液相檢測產(chǎn)物生成量。

1U：在上述條件下，1 min產(chǎn)生1 μmol甲霜靈酸所需的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選和鑒定

2.1.1 菌種的篩選 對采集到的多份土壤和污泥樣品進行富集培養(yǎng)，有一個培養(yǎng)物中檢測到對甲霜靈有降解效果。在10-7進行稀釋涂布后的固體培養(yǎng)基平板上根據(jù)菌落不同特征選取了50個單菌落，再將其分別接種到復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)基，成功獲得了一株能不對稱水解甲霜靈的菌株，發(fā)酵培養(yǎng)初始和2 d，分別取樣進行液相色譜分析，結(jié)果見圖1，將該菌株初步命名為zjut528。

從圖1可以看出，菌株zjut528在復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)液（含外消旋甲霜靈1 g·L-1）中水解甲霜靈，反應(yīng) 2 d，R-甲霜靈已被完全水解為 R-甲霜靈酸，S-甲霜靈未發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)物收率近50%，產(chǎn)物甲酸靈酸的主構(gòu)型為R型，對映體過量值eep> 99.9%。

2.1.2 菌株 zjut528的形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定 菌株zjut528在固體培養(yǎng)基平板上菌落均呈圓形，表面隆起，邊緣整齊，濕潤，光滑，白色，不透明，隨著時間的推移，菌落未見有明顯顏色變化。革蘭染色后zjut528的形態(tài)特征為革蘭陰性菌，呈球桿狀。

將菌株zjut528基因組送到某生物公司進行16S rDNA鑒定。將測序得到的原序列經(jīng)去載體、拼接后獲得較完整的16S rDNA序列，長度為1236 bp，將該序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索Genbank中相關(guān)菌株的16S rDNA序列，并進行核苷酸同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)它與 Albibactermethylovoransstrain DSM22840T相似性達到了99%，該菌株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。16S rDNA分子鑒定一般只能鑒定到屬，所以該菌株只能鑒定為Albibacter屬，該屬目前只有一個種。

圖1 用菌株zjut528水解外消旋甲霜靈反應(yīng)初始(a)和第2 d時(b)反應(yīng)液的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograph of reactant at beginning (a) and the 2nd day(b) of hydrolysis of racemic metalaxyl catalyzed by zjut528 cells

2.1.3 菌體細胞催化甲霜靈不對稱水解的性能 用菌體催化外消旋體甲霜靈的水解，甲霜靈濃度 50 g·L-1，濕菌體（含水量81%）:甲霜靈=0.3:1（質(zhì)量比），以異丙醇（終濃度20%, 體積分數(shù)）作助溶劑，在pH=8.0下反應(yīng)28 h，產(chǎn)物R-甲霜靈酸的收率是47.1%，eep> 99.9%。

2.2 酶的分離純化

2.2.1 鹽析 當硫酸銨飽和度在20%～40%時，酶活主要存在于上清中。當硫酸銨飽和度在 40%～60%時，上清中酶活明顯減少，沉淀中酶活明顯增加。當硫酸銨飽和度高于60%時，幾乎所有目的蛋白都沉淀下來。

2.2.2 陰離子交換色譜分離 用陰離子交換柱對鹽析后的粗酶液進行分離，在 0.5和 1.0 mol·L-1的NaCl濃度洗脫液中檢測出了酶活性，此二者對甲霜靈有著相同的水解效果，將上述2組活性蛋白液合并，超濾濃縮用于凝膠過濾色譜分離。

圖2 菌株zjut528的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of strain zjut528

圖3 在離子交換和凝膠過濾層析中各收集液的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of elution portions from ion exchange and gel filtration chromatography

2.2.3 凝膠過濾色譜分離 對離子交換色譜分離后的活性蛋白液進行凝膠過濾色譜分離，在 26～44 min之間出現(xiàn)一個大的洗脫峰，經(jīng)過驗證該峰具有酶活性。

2.2.4 色譜分離收集液的SDS-PAGE分析 對兩個色譜分離步驟中所得收集液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，離子交換色譜分離收集到的活性峰中雜蛋白的含量已經(jīng)很少。再經(jīng)由凝膠過濾色譜分離后，目的蛋白在SDS-PAG凝膠上為單一條帶，分子量約為40×103，經(jīng)轉(zhuǎn)PVDF膜后外送進行 N端測序。測得 N端 10個氨基酸序列為NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。

2.3 酯酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

所用酶均為分離純化后的電泳純酶。

2.3.1 溫度對酶活及穩(wěn)定性影響 在pH 8.0下，考察了20～60℃范圍內(nèi)溫度對酶活的影響，以最高酶活為100%，結(jié)果如圖4所示，該酯酶在40℃下酶活最高，50℃仍保留70%酶活，但在60℃時已經(jīng)完全失活。

圖4 溫度對酶活的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

圖5 溫度對酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme’s stability

在pH 8.0下，將酶按一定溫度保溫4 h，不同溫度下酶的穩(wěn)定性如圖5所示。20～40℃下酶較為穩(wěn)定，4 h后仍保留90%以上的初始酶活；40～50℃下剩余酶活迅速下降，50℃下只保留約20%的初始酶活，60℃處理4 h后已經(jīng)檢測不到剩余活性。

2.3.2 pH對酶活及穩(wěn)定性影響 在 37℃下，分別測定不同pH下的酶活，以最高酶活為100%，結(jié)果如圖6所示，酶在pH為9.0時酶活最高，pH為10.0時仍有90%的酶活，由于甲霜靈在pH為11.0條件下自身會發(fā)生水解，因此未測定pH在10.0以上的酶活。該酶在酸性條件下，酶活迅速下降，在 pH為4.0時，幾乎檢測不到活性。

圖6 pH對酶活的影響Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

4℃下將酶在不同pH下保溫4 h，酶的pH穩(wěn)定性如圖7所示。在pH為5.0～10.0下，剩余酶活仍保留初始時的90%以上，而在pH為4.0時，剩余酶活只有初始時的43%。

圖7 pH對酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on enzyme’s stability

2.3.3 金屬離子對酶活影響 分別測定加入 2 mmol·L-1不同金屬離子后酶液的酶活，以不加金屬離子時的酶活（CK）為100%，結(jié)果如圖8所示，F(xiàn)e2+、Mn2+、Zn2+能促進酶活，F(xiàn)e3+對酶活有一定的抑制，其他金屬離子對酶活的影響較小。

圖8 金屬離子對酶活的影響Fig.8 Effect of various metal ions (2 mmol·L-1) on enzyme’s activity

2.3.4 有機溶劑的加入對酶活的影響 測定加入不同有機溶劑 (濃度20%(體積))對酶活的影響，以未加有機溶劑為100%(CK)，結(jié)果如圖9所示，乙腈、甲醇、異丙醇、丙酮、二異丙醚、環(huán)己烷、正己烷的加入均對酶活有明顯的促進作用，其中異丙醇促進作用最大，提高到原來的約2.5倍。因為甲霜靈的溶解度不高（約 8 g·L-1），溶劑對酶活的促進作用可能來源于它們對底物的助溶作用。液相色譜檢測表明，不同有機溶劑對酶的選擇性沒有明顯的影響，產(chǎn)物對映體過量值eep均大于99%。

圖9 有機溶劑的加入對酶活的影響Fig. 9 Effect of various organic solvent (20%, vol) on enzyme activity in aqueous solution

2.3.5 酶動力學(xué)測定 測定了不同甲霜靈濃度下的酶反應(yīng)速率，結(jié)果如圖10所示。在低濃度下，反應(yīng)近似于一級反應(yīng)，隨著底物濃度的增加，反應(yīng)由一級反應(yīng)向零級反應(yīng)過渡，與典型米氏方程曲線相符。用Lineweaver Burk雙倒數(shù)作圖法并進行曲線擬合（圖10 內(nèi)插圖），求得 Vmax=0.18 mmol·L-1·min-1，Km=2.29 mmol·L-1。測定時反應(yīng)體系中酶濃度[E]=0.21×10-3mol·L-1，因為Kcat=Vm/[E]， 所 以 得Kcat=0.85 min-1。

圖10 不同甲霜靈濃度下的酶反應(yīng)速率（內(nèi)插圖是用Michaelis–Menten方程雙倒數(shù)作圖法對實驗數(shù)據(jù)(●)進行了擬合）Fig.10 Velocity of reaction catalyzed by purified esterase at different metalaxyl concentration(Data (●) were fit for Michaelis–Menten equation in double-reciprocal plotin inserted figure)

2.4 生物拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈的工藝

設(shè)計了利用Albibacter sp. zjut528細胞作催化劑制備R-甲霜靈的新工藝（工藝流程如圖11所示）。先利用菌株細胞催化外消旋甲霜靈不對稱水解，然后將水解產(chǎn)物 R-甲酸靈酸與未反應(yīng)的底物 S-甲霜靈進行分離。分離得到的R-甲霜靈酸和甲醇進行酯化反應(yīng)合成R-甲霜靈；分離得到的S-甲霜靈進行消旋化，生成的外消旋體可以返回細胞催化步驟重新利用。

2.4.1 細胞催化甲霜靈不對稱水解 甲霜靈經(jīng)細胞催化水解后，得到的產(chǎn)物為R-甲霜靈酸，產(chǎn)物收率47.1%，對映體過量值eep> 99.9%。經(jīng)萃取分離、旋蒸后制得了R-甲霜靈酸與S-甲霜靈。R-甲霜靈酸的ee值 > 99.9%，S-甲霜靈ee值為99.4%。

2.4.2 R-甲霜靈的制備 R-甲霜靈酸經(jīng)二氯亞砜催化與甲醇反應(yīng)4 h后，產(chǎn)物的收率為94.2%。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液通過萃取、旋蒸等分離操作最終得到了R-甲霜靈產(chǎn)品，產(chǎn)品的液相色譜檢測結(jié)果如圖12所示，R-甲霜靈的純度為96.2%，對映體過量值ee為 99.3%。酯化步驟（包括分離）產(chǎn)物的總收率80.6%。

2.4.3 S-甲霜靈消旋化研究 加入消旋催化劑，在30～60℃范圍內(nèi)，研究了S-甲霜靈的消旋化情況。溫度越高，消旋速度越快。60℃下消旋速度最快，反應(yīng)6 h，對映體過量值從99.4%減小到4.2%。

圖11 用Albibacter sp. zjut528細胞作催化劑拆分外消旋甲霜靈制備R-甲霜靈的工藝流程Fig.11 Flow chart of production of R-metalaxyl by resolution of racemic metalaxyl using Albibacters sp. zjut528 cells as catalyst

圖12 新拆分工藝所得終產(chǎn)品R-甲霜靈的HPLC圖Fig.12 HPLC chromatograph of final-product of R-metalaxyl produced by new resolution process using Albibacters sp. zjut528 cells as catalyst

3 結(jié) 論

（1）本研究從土壤、污泥等樣品中，篩選到一株可以不對稱水解甲霜靈的革蘭陰性菌，對該菌株進行了生理生化和分子生物學(xué)鑒定，命名為Albibactersp.zjut528。當?shù)孜餄舛葹?50 g·L-1，濕菌體（含水量81%）:底物=0.3:1（質(zhì)量比），反應(yīng)28 h，產(chǎn)物得率為 47.1%，主產(chǎn)物為R-甲霜靈酸，eep>99.9%。

（2）將菌株細胞破碎得到的粗酶液，經(jīng)鹽析、陰離子交換色譜分離、凝膠過濾色譜分離得到一個SDS-PAGE電泳純的酯酶，分子量約為40×104，酶蛋白N端10個氨基酸序列為NH2-Ala-Ala-Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu。該酶最適溫度為40℃。20～40℃穩(wěn)定性較好。最適pH為9.0，在pH 5.0～10.0范圍穩(wěn)定。2 mmol·L-1的Fe2+、Mn2+、Zn2+對酶活有促進作用，F(xiàn)e3+對酶活有一定的抑制作用。在含有20%的乙腈、異丙醇、丙酮、二異丙醚、環(huán)己烷、正己烷的水溶液中，酶活均比在純水相中有較明顯的提高。該酶反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程，Vm為 0.18 mmol·L-1·min-1，Km為2.29 mmol·L-1，Kcat為 0.85 min-1。

（3）建立了一條利用Albibacterssp.zjut528細胞作催化劑對外消旋甲霜靈進行拆分制備R-甲霜靈的工藝路線。其中第一步外消旋甲霜靈經(jīng)細胞催化水解后，得到的主產(chǎn)物為R-甲霜靈酸，eep> 99%，產(chǎn)物得率47.1%。反應(yīng)結(jié)束后，將R-甲霜靈酸和未反應(yīng)的S-甲霜靈分離。對分離出的S-甲霜靈（ee為99.4%）進行消旋化重新利用，60℃反應(yīng)6 h，甲霜靈的對映體過量值ee下降為 4.2%。對分離出的R-甲霜靈酸和甲醇進行酯化反應(yīng)，經(jīng)分離純化，得到的終產(chǎn)品R-甲霜靈的純度是96.2%，ee值為99.3%。

與用商品酶Lipase PS拆分中間體制備R-甲霜靈[30]的工藝相比，本工藝的催化劑成本低得多（催化劑是菌體細胞）、產(chǎn)品的ee值更高，是一個有工業(yè)化價值的生產(chǎn)工藝。

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date:2017-04-13.

ZHANG Zhaohui, zzh@zjut.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (31601390).

Production ofR-metalaxyl by resolution of racemic metalaxyl using biocatalyst

ZHANG Zhaohui, ZHANG Likun, LU Yuele
(College of Biological Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310014,Zhejiang,China)

A Gram-negative bacterium was isolated from the soil and sludge samples, which had high activity for enantioselective hydrolysis of (R,S)-metalaxyl. The strain was identified asAlbibactersby 16S rDNA sequence analysis. It was namedAlbibacterssp.zjut528. At 37℃, 15 g·L-1of the wet cells (81% water content) catalyzed the hydrolysis of (R,S)-metalaxyl at the concentration of 50 g·L-1for 28h, the yield reached 47.1% and the main product wasR-metalaxyl acid witheep> 99.9%. In order to isolate its intracellular esterase, the cells were disrupted by ultrasonic. After centrifugation, the supernatant was treated by ammonium sulfate precipitation,followed by ion-exchange chromatography and gel filtration chromatography. A SDS-PAGE electrophoresis-pure esterase protein was obtained with a molecular mass of about 40×103. Its N-terminal amino acid sequence was determined as NH2-Ala-Ala -Lys-Ala-Pro-Leu-Arg-Leu-Lys-Glu. Its optimum catalytic temperature and pH were 40℃ and 9.0, respectively. The enzyme was stable at 20—40℃ and pH 5.0—10.0. 0.2 mmol·L-1of Fe2+, Mn2+,Zn2+can improve its activity, but Fe3+inhibited it. Its activity was highly improved when some organic solvents,such as acetonitrile, isopropanol, acetone, isopropyl ether, cyclohexane andn-hexane, were added at the concentration of 20% (vol). The Michaelis-Menten kinetics parameters for the enzyme wereVm=0.18 mmol·L-1·min-1,Km=2.29 mmol·L-1andKcat=0.85 min-1. A new process for producingR-matalaxyl fromR,S-matalaxyl was established by usingAlbibacterssp.zjut528 cells as the catalyst. First, the cells catalyzed enantioeletive hydrolysis of (R,S)-matalaxyl to produceR-metalaxyl. After reaction, theR-metalaxyl acid and the unreactedS-matalaxyl were separated by extraction.R-Metalaxy acid was esterified with methanol to produceR-metalaxyl. Followed by some separation steps, the final product ofR-metalaxy was obtained. Its purity was 96.2% andeevalue was 99.3%. The unreactedS-metalaxyl can be reused by racemization. After heated for 6 h at 60℃, itseevalue reduced from 99.4% to 4.2%.

biocatalysis; bioprocess; hydrolysis;R,S-metalaxyl;R-metalaxyl; strain screening and identification;esterase;Albibacters

Q 814

A

0438—1157（2017）11—4229—10

10.11949/j.issn.0438-1157.20170398

2017-04-13收到初稿，2017-08-17收到修改稿。

聯(lián)系人及第一作者：張朝暉（1968—），男，博士，副教授。

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31601390）。