奧希替尼對(duì)EGFR T790M突變陽(yáng)性NSCLC患者的療效及對(duì)miR-21水平的影響

戴瑋婧，李洪濤，戴丹菁

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江哈爾濱 150001；2湖北省荊州市第一人民醫(yī)院腫瘤科，湖北荊州 434000；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院漢川醫(yī)院腫瘤科，湖北孝感 431699)

肺癌是發(fā)生于肺泡上皮或支氣管黏膜上皮的惡性腫瘤，病死率較高，其中約80%的患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，且研究報(bào)道其5年生存率僅為10%～12%。目前針對(duì)晚期NSCLC的治療，臨床上仍以化療為主，但療效不佳[1]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷發(fā)展及進(jìn)步，靶向治療逐漸成為晚期NSCLC治療的熱點(diǎn)，其中表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變晚期NSCLC患者的一線治療方案，雖其最初反應(yīng)率較高，但仍有20%～30%的EGFR基因突變NSCLC患者會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性耐藥，且開(kāi)始治療有效的患者在治療過(guò)程中亦會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥，其中50%～60%的耐藥機(jī)制為T790M突變所導(dǎo)致。奧希替尼是第3代不可逆的選擇性EGFR突變抑制劑，適用于第1代EGFR-TKI耐藥后T790M突變陽(yáng)性的晚期NSCLC患者[2-3]。本研究分析了奧希替尼對(duì)EGFR T790M突變陽(yáng)性NSCLC患者的療效及對(duì)血清miR-21水平的影響，旨在為EGFR-TKI耐藥后NSCLC患者治療方式的優(yōu)化進(jìn)一步提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2019年1月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的EGFR-TKI耐藥后T790M突變陽(yáng)性的晚期NSCLC患者100例。所有患者均已簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。根據(jù)治療方式將所有研究對(duì)象分為研究組及對(duì)照組，各50例。研究組(采用奧希替尼治療)中男32例，女18例；年齡52～73歲，平均(62.5±9.0)歲；病理類型：鱗癌18例，腺癌28例，大細(xì)胞癌4例。對(duì)照組(采用培美曲塞+順鉑常規(guī)化療)中男30例，女20例；年齡54～71歲，平均(62.8±8.8)歲；病理類型：鱗癌20例，腺癌27例，大細(xì)胞癌3例。兩組患者性別、年齡、病理類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)病理證實(shí)是NSCLC且為第1代EGFR-TKI耐藥后T790M突變陽(yáng)性的晚期(Ⅲb～Ⅳ期)患者；(2)所有患者行胸部CT檢查示靶病灶≥1個(gè)且預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月；(3)所有患者及家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原發(fā)性惡性腫瘤或多臟器轉(zhuǎn)移者；(2)心、肝、腦等重要臟器或骨髓功能障礙者。

1.3儀器與試劑 TRI Reagent BD購(gòu)自美國(guó)MRC公司,PRISM 7900實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，微小核糖核酸及U6引物序列由上海生工生物工程(股份)有限公司合成。

1.4方法

1.4.1治療方法 (1)研究組：采用奧希替尼治療，劑量為80 mg，1次/日，持續(xù)服用直至病情進(jìn)展或毒性不可耐受。(2)對(duì)照組：采用培美曲塞+順鉑化療，其中第1日給予培美曲塞500 mg/m2,第1～5天給予順鉑20 mg/m2，行4～6個(gè)周期的治療。以上兩組患者治療期間定期復(fù)查，并隨訪1年。

1.4.2檢測(cè)方法 治療前后對(duì)兩組患者分別采集空腹靜脈血3 mL，常規(guī)處理后進(jìn)行RNA的分離提取并采用RT-PCR進(jìn)行分析，步驟如下。(1)血清總RNA提取。應(yīng)用TRI Reagent BD提取血清標(biāo)本的總RNA。(2)反轉(zhuǎn)錄cDNA的生成。制備反轉(zhuǎn)錄混合反應(yīng)液：總RNA 1.0 μg，dNTP(水平為2.5 mmol/L)2.0 μL；10×RT-PCR緩沖液2.0 μL，RT特異引物1.0 μL，莫羅尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV，10 U/μL)2.0 μL，RNA酶抑制劑(40 U/μL)0.3 μL，加入無(wú)核酸酶高純度水至總體積20.0 μL。反應(yīng)條件：16 ℃，30 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min；4 ℃終止反應(yīng)。(3)RT-PCR。檢測(cè)引物探針：U6上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，U6下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；miR-21上游引物為5′-ACA CTC CAG CTG GGT AGC TTA TCA G-3′，miR-21下游引物為5′-CAA CTG GTG TCG TGG AGT CG-3′。配制反應(yīng)體系：dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2溶液1.5 μL，Taq聚合酶1.0 U，SybergreenⅠ染料0.25 μL，10 μmol/L的PCR特異引物正鏈1.0 μL；10 μmol/L的PCR特異引物反鏈1.0 μL；cDNA或DNA 1.0 μL；加水至總體積為25.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)；4 ℃ 5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR反應(yīng)曲線，以U6作為內(nèi)參，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。ΔΔCt=ΔCt(待測(cè)基因)-ΔCt(內(nèi)參)。

1.5觀察指標(biāo) (1)根據(jù)RECIST1.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[4]比較兩組患者治療后臨床療效的差異:完全緩解(CR)為靶病灶完全消失；部分緩解(PR)為靶病灶半徑的總和減少≥30%；穩(wěn)定(SD)為靶病灶未減小及無(wú)進(jìn)展；進(jìn)展(PD)為靶病灶半徑總和增加≥20%；疾病控制率(DCR)=(CR例數(shù)+PR例數(shù)+SD例數(shù))/總例數(shù)×100%。(2)比較兩組患者治療前后miR-21水平的差異。(3)比較兩組患者治療后不良反應(yīng)發(fā)生率的差異。(4)隨訪結(jié)束時(shí)對(duì)兩組患者的預(yù)后情況[無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)]進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者治療后的臨床療效比較 治療后研究組患者的DCR高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.574，P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療后的臨床療效比較[n(%)]

2.2兩組患者治療前后血清miR-21水平比較 治療前兩組患者血清miR-21水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而治療后對(duì)照組患者血清miR-21水平較研究組顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前后血清miR-21水平比較

2.3兩組患者治療后不良反應(yīng)發(fā)生率比較 治療后兩組消化道反應(yīng)、皮疹、貧血、甲溝炎等不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組患者治療后不良反應(yīng)發(fā)生率比較[n(%)]

2.4兩組患者的預(yù)后情況比較 隨訪結(jié)束時(shí)，研究組患者的PFS為(10.2±2.3)個(gè)月，顯著長(zhǎng)于對(duì)照組的(7.1±1.6)個(gè)月,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

EGFR基因突變是NSCLC較為常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)因素，而對(duì)于EGFR基因突變且無(wú)耐藥基因的晚期NSCLC患者，EGFR-TKI常被推薦為一線用藥，但在臨床治療過(guò)程中，仍有部分患者會(huì)相繼產(chǎn)生耐藥，其中因T790M突變陽(yáng)性導(dǎo)致的獲得性耐藥約占60%。因此，如何合理有效地應(yīng)對(duì)EGFR-TKI等靶向藥物的耐藥，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷下的全程管理已經(jīng)成為晚期NSCLC個(gè)體化診療的重要研究方向。奧希替尼的出現(xiàn)將起到重要的作用，其主要與腫瘤細(xì)胞內(nèi)C797形成不可逆的共價(jià)結(jié)合，進(jìn)而抑制絡(luò)氨酸激酶磷酸化及EGFR靶點(diǎn)的激活，并阻斷EGFR同源二聚化及其下游信號(hào)通路相關(guān)表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)T790M突變陽(yáng)性細(xì)胞凋亡，最終起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功效[5-8]。目前奧希替尼在一些臨床試驗(yàn)中已表現(xiàn)出較好的安全性及有效性，但關(guān)于奧希替尼和以鉑類為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化療方案的比較研究較少，因此，本研究分析了奧希替尼對(duì)EGFR T790M突變陽(yáng)性NSCLC患者的療效及對(duì)血清miR-21水平的影響。

本研究結(jié)果顯示，治療后研究組患者的DCR高于對(duì)照組(P<0.05)，這表明奧希替尼相較于以鉑類為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化療方案，對(duì)于EGFR T790M突變陽(yáng)性的晚期NSCLC患者短期療效更佳[9]。文獻(xiàn)[10]報(bào)道微小核糖核酸是一種小型的且無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，同時(shí)微小核糖核酸可作為血清學(xué)標(biāo)志物對(duì)胃癌、肺癌等諸多惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷及預(yù)后判斷。另外有研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸可參與調(diào)控多種腫瘤的耐藥過(guò)程，如可通過(guò)調(diào)控EGFR通路影響腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，其中miR-21被證實(shí)在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，且進(jìn)一步針對(duì)miR-21的功能學(xué)研究顯示，miR-21在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及繼發(fā)性耐藥中起著十分重要的調(diào)控作用[11]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療前兩組患者的血清miR-21水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而治療后對(duì)照組患者的血清miR-21水平較研究組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因?yàn)閙iR-21水平升高可體現(xiàn)患者繼發(fā)性耐藥過(guò)程加快，而研究組升高幅度較對(duì)照組小，則說(shuō)明其繼發(fā)性耐藥的過(guò)程減緩。該結(jié)果從血清學(xué)方面進(jìn)一步顯示出奧希替尼治療EGFR T790M突變陽(yáng)性晚期NSCLC患者更具優(yōu)勢(shì)，可有效減緩患者繼發(fā)性耐藥的進(jìn)程[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，治療后兩組各不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明奧希替尼的臨床安全性也較高[13]。本研究對(duì)兩組患者的預(yù)后情況進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)隨訪結(jié)束時(shí)，研究組患者的PFS顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，與文獻(xiàn)[14]結(jié)果一致。

綜上所述，EGFR-TKI耐藥后，奧希替尼對(duì)EGFR T790M突變陽(yáng)性的晚期NSCLC患者的療效較好，同時(shí)具有較高的臨床安全性且可明顯改善預(yù)后，值得臨床推廣應(yīng)用。