食管癌組織中TROP2的表達(dá)水平及臨床意義

庹曉霞

(四川省廣元市婦幼保健院檢驗(yàn)科，四川廣元 628000)

食管癌是發(fā)生于食管上皮的消化道惡性腫瘤，具有一定的地域分布差異，我國(guó)是食管癌發(fā)病率及病死率較高的國(guó)家之一，死亡患者占全部惡性腫瘤死亡患者的1/4，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。目前外科手術(shù)切除仍為食管癌治療的首選方案，但因早期食管癌無明顯特異性表現(xiàn)，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，術(shù)后預(yù)后較差。因此，早期診斷并評(píng)估疾病進(jìn)展趨勢(shì)是改善食管癌患者預(yù)后的有效途徑。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)基因的表達(dá)也逐漸被用于惡性腫瘤的診斷及預(yù)后評(píng)估中，為疾病的防治提供了一定參考。人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原-2(TROP2)是一種跨膜表面糖蛋白，因在人滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)量較高而得名，其表達(dá)量高也被認(rèn)為是胎盤具有較強(qiáng)侵襲力的重要原因[2-3]。近年的研究證實(shí)，TROP2的表達(dá)也與人類惡性腫瘤相關(guān)，其在多種實(shí)體腫瘤中均存在高表達(dá)，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切聯(lián)系[4-5]。目前TROP2的表達(dá)與食管癌的關(guān)系研究較缺乏，本研究對(duì)食管癌組織中TROP2及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)基因mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，分析其相關(guān)性，并對(duì)TROP2蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，分析其與臨床指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2009年7月至2018年9月于本院行外科手術(shù)的85例食管癌患者作為研究對(duì)象，以手術(shù)切除的食管癌組織作為研究標(biāo)本。食管癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：初治患者；經(jīng)病理學(xué)診斷為食管癌；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：行外科手術(shù)前進(jìn)行放療、化療及其他療法者；合并心腦血管疾病者；合并自身免疫性疾病者。85例食管癌患者中男59例，女26例；年齡35～70歲，中位年齡53歲；鱗癌75例，腺癌10例；部位：胸上段3例，胸中段49例，胸下段33例；分化程度：高分化6例，中分化47例，低分化32例；腫瘤浸潤(rùn)深度：黏膜及黏膜下層6例，肌層30例，外膜49例；病理分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期48例，Ⅲ期18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，未轉(zhuǎn)移者65例。另從這85例食管癌患者中選擇50例距食管病變邊緣5 cm以上的癌旁組織作為對(duì)照，所有對(duì)照標(biāo)本組織均經(jīng)病理科證實(shí)無異常改變。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集及保存 食管癌組織取手術(shù)后病灶中心組織，癌旁組織取距食管病變邊緣5 cm以上的正常組織。所有標(biāo)本取得后立即置于液氮中保存。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) (1)總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：采用Trizol法進(jìn)行組織標(biāo)本RNA提取，采用StarScriptⅡ First-strand cDNA Synthesis Mix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA進(jìn)行水平檢測(cè)。(2)RT-PCR：引物序列，TROP2(正向5′-TAC GAG CAG CCC ACC ATC C-3′，反向5′-TCG GTT CCT TTC TCA ACT CCC-3′)；MMP-9(正向5′-GCG GAT CCA GCG CCC AGA GAC AC-3′，反向5′-TGG ACG ATG CCT GCA ACG TG-3′)；E-cadherin(正向5′-CGA CCC AAC CCA AGA ATC TA-3′，反向5′-AAT GGC AGG AAT TTG CAA TC-3′)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，正向5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC A-3′，反向5′-GAT AGC ACA GCC TGG ATA GCA A-3′)。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(3)結(jié)果觀察及統(tǒng)計(jì)：采用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以各基因mRNA表達(dá)與GAPDH條帶亮度比值作為表達(dá)量。

1.2.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TROP2蛋白表達(dá) (1)免疫組織化學(xué)染色：組織標(biāo)本采用多聚甲醛固定，石蠟包埋并切取4 μm的石蠟切片。石蠟切片脫蠟后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，采用3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，過氧化物酶滅活后PBS沖洗3次。加入5%的牛血清清蛋白，37 ℃孵育10 min。滴加羊抗人TROP2多克隆抗體(1∶100，英國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗。加入即用型羊抗兔鼠二抗(英國(guó)Abcam公司)37 ℃孵育30 min，PBS沖洗。加入S-P溶液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色，鏡檢顯色滿意后可終止顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明、封片等操作完成制片。(2)結(jié)果判定：免疫組織化學(xué)切片鏡檢，根據(jù)染色細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的百分比進(jìn)行染色范圍計(jì)分，其中無染色為0分；不足10%為1分；10%～50%為2分；>50%～80%為3分；>80%為4分。根據(jù)染色細(xì)胞的染色深淺進(jìn)行染色強(qiáng)度計(jì)分，其中無著色為0分；黃色(+)為1分；淺棕色(++)為2分；棕褐色(+++)為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度及范圍的積分(乘積)評(píng)價(jià)陽性表達(dá)情況：積分0～3分為陰性表達(dá)(-)；積分>3～6分為弱陽性表達(dá)(+)；積分>6～9分為陽性表達(dá)(++)；積分>9～12分為強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)；以積分≥4分判定為陽性表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA在食管癌組織中的表達(dá)情況 RT-PCR結(jié)果顯示，癌旁組織中TROP2、MMP-9基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于食管癌組織，E-cadherin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯高于食管癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)分析提示，TROP2基因mRNA表達(dá)量與MMP-9基因mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.326，P<0.05)，與E-cadherin基因mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.307，P<0.05)。見圖1。

注：A為電泳結(jié)果；B為TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果；與癌旁組織比較，*P<0.05。圖1 TROP2、MMP-9、E-cadherin基因mRNA在食管癌組織中的表達(dá)情況

2.2TROP2蛋白在食管癌組織中的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TROP2蛋白在食管癌癌旁組織中未見或少量表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色積分0～6分，平均(4.15±1.07)分，陽性表達(dá)率為14.00%(7/50)；TROP2蛋白在食管癌中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核不著色，免疫組織化學(xué)染色積分0～12分，平均(6.98±2.71)分，陽性表達(dá)率為42.35%(36/85)。食管癌組織TROP2蛋白免疫組織化學(xué)染色積分顯著高于癌旁組織，陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。部分食管癌組織TROP2蛋白表達(dá)情況見圖2。

注：A為陰性表達(dá)；B為陽性表達(dá)。圖2 食管癌組織中TROP2蛋白表達(dá)情況(×200)

2.3TROP2蛋白表達(dá)與食管癌臨床資料的關(guān)系 腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與食管癌患者TROP2蛋白表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 TROP2蛋白表達(dá)與食管癌臨床資料的關(guān)系[n(%)]

2.4TROP2蛋白表達(dá)的影響因素分析 多因素Logistic回歸分析提示，腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分期與TROP2蛋白表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 TROP2蛋白表達(dá)陽性的影響因素分析

2.5不同TROP2蛋白表達(dá)的食管癌患者生存曲線分析 85例患者均進(jìn)行隨訪，隨訪截止日期為2019年3月，隨訪時(shí)間為5～90個(gè)月。Log-rank檢驗(yàn)顯示，TROP2蛋白陽性表達(dá)組生存率明顯低于陰性表達(dá)組(χ2=8.623，P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線見圖3。

圖3 不同TROP2蛋白表達(dá)的食管癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.6影響食管癌預(yù)后的COX多因素分析 COX多因素分析提示，食管癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、病理分期及TROP2蛋白表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響食管癌預(yù)后的COX多因素分析

3 討 論

TROP2基因所編碼的產(chǎn)物為含323個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是一種腫瘤相關(guān)抗原，在角膜、胰腺等諸多器官中均有表達(dá)，其在多層上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)量較高[6]。近年來的研究證實(shí)，TROP2基因在大腸癌、肺癌、乳腺癌等諸多實(shí)體瘤中均存在高表達(dá)，且可能與腫瘤的侵襲性相關(guān)，可作為部分腫瘤基因治療的靶點(diǎn)[7]。

本研究從轉(zhuǎn)錄水平分析食管癌患者TROP2基因及其下游MMP-9、E-cadherin基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示食管癌組織中存在TROP2、MMP-9高表達(dá)及E-cadherin低表達(dá)。既往研究表明，TROP2、MMP-9高表達(dá)及E-cadherin低表達(dá)是細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要標(biāo)志[8]，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)TROP2及其下游基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。免疫組織化學(xué)法均提示食管癌組織存在TROP2蛋白高表達(dá)。此外，食管癌患者TROP2蛋白表達(dá)與患者腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。多因素Logistic回歸分析提示,腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分期與TROP2蛋白表達(dá)相關(guān)，提示TROP2蛋白可能參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展過程。既往關(guān)于TROP2在食管癌組織的表達(dá)相關(guān)研究較少，周永清等[9]以胃癌組織作為研究材料，證實(shí)胃癌組織中TROP2 蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期相關(guān)；國(guó)外一項(xiàng)研究也證實(shí)，TROP2 蛋白在肺腺癌組織中存在高表達(dá)(67%)[10]。本研究在前人研究結(jié)果基礎(chǔ)上,進(jìn)一步證實(shí)TROP2蛋白參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展。目前TROP2蛋白影響惡性腫瘤生物學(xué)行為的相關(guān)機(jī)制尚未明確，研究認(rèn)為可能與TROP2 蛋白參與EMT 相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)。EMT是上皮細(xì)胞在病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，這一過程可伴細(xì)胞去極性、細(xì)胞形態(tài)改變、上皮細(xì)胞分子標(biāo)記減少、基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)成員活性增加等[11-12]。楊勇等[13]開展的一項(xiàng)細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)，抑制食管癌TROP2基因表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲的能力，其機(jī)制與下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、磷脂酰肌醇-3激酶相關(guān)。

本研究分析了TROP2蛋白與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，TROP2蛋白陽性表達(dá)患者生存率明顯低于陰性表達(dá)患者，這一結(jié)果與既往其他惡性腫瘤的相關(guān)報(bào)道一致[14-15]。如前文研究所示，TROP2蛋白表達(dá)量與腫瘤侵襲性呈一定程度相關(guān)，TROP2蛋白表達(dá)陽性患者可能病情進(jìn)展更為迅速，局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高，因此預(yù)后相對(duì)較差。目前多數(shù)研究認(rèn)為食管癌患者的預(yù)后受到腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期等諸多因素的影響[16-17]，本研究COX多因素分析提示，在校正其他因素后，TROP2蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)為低表達(dá)患者的1.454倍，提示TROP2蛋白的表達(dá)情況與食管癌患者預(yù)后相關(guān)，可作為早期預(yù)后評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)。但本研究存在一定局限，因樣本量有限，在預(yù)后評(píng)估方面對(duì)術(shù)后治療方案未進(jìn)行分析，可能使結(jié)果存在一定誤差，下一步工作仍將擴(kuò)大樣本量，并將治療相關(guān)因素納入研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，食管癌組織存在TROP2蛋白表達(dá)明顯升高，其表達(dá)情況與患者腫瘤侵襲性及預(yù)后均有一定關(guān)系。