52例多發(fā)性骨髓瘤患者細胞免疫表型分析*

蘇 榮,黎觀霞,呂微風,楊延斌,唐少俊

(1.廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗科，廣東佛山528000；2.廣東醫(yī)科大學檢驗學院,廣東湛江524000；3.廣東省佛山市中醫(yī)院統(tǒng)計室,廣東佛山 528000；4.廣東省佛山市中醫(yī)院計算機網絡中心，廣東佛山 528000)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種好發(fā)于中老年人的血液系統(tǒng)疾病，發(fā)病率位于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位[1]，是一種起源于B淋巴細胞分化的漿細胞的克隆性增殖性疾病，主要是以漿細胞的惡性增殖和溶骨損壞為臨床特征。患者多表現(xiàn)為腎功能受影響，分泌M蛋白，出現(xiàn)貧血、骨骼破壞、骨痛和免疫系統(tǒng)功能異常等[2-3]，存活率低。大部分MM患者經治療后病情可緩解，生存期也明顯延長，但仍有部分患者病情會進一步發(fā)展，其原因為對患者病情發(fā)展階段評估不準確，使臨床醫(yī)師難以確定患者在后續(xù)治療過程中的時間點、治療方案和藥物濃度。因MM患者病情還受其分泌的免疫球蛋白和伴隨單株免疫球蛋白輕鏈型的影響，故本研究對MM患者的漿細胞免疫表型(CD38、CD138、CD19、CD56、CD117、CD200)及其分泌的免疫球蛋白、血清游離輕鏈進行分析，以期為MM患者的病情監(jiān)測、療效評估及預后判斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集廣東省佛山市中醫(yī)院2017年1月1日至2018年12月31日就診的52例MM患者(均為輕鏈型)，其中男28例、女24例，年齡40～83歲。所有MM患者的診斷均符合《中國血液病診斷指南》中相關標準。按照Durie-Salmon臨床分期(DS分期)，52例MM患者中Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期26例。

1.2儀器與試劑 貝克曼庫爾特Navios流式細胞儀及配套試劑(美國Beckman公司)；紅細胞裂解液，磷酸鹽緩沖液(PBS)，CD138-PE，CD38-FITC，CD19-PC7，CD56-PEcy5，CD117-PE，CD200-PE單克隆抗體；Hydras瓊脂糖凝膠電泳儀及配套試劑(血清蛋白電泳稀釋液A、B)；瑞氏-姬姆薩染液。

1.3方法

1.3.1標本采集 采集52例MM患者3 mL靜脈血和3 mL肝素抗凝骨髓液備用，將患者3 mL靜脈血離心，取上層血清待測。

1.3.2血清免疫固定電泳 取分離好的靜脈血清進行瓊脂糖凝膠電泳。先對患者血清標本進行血清蛋白電泳(在5個泳道上加入10 μL稀釋后的血清進行電泳)。之后分別在各泳道加入蛋白固定劑和5種類型的抗血清觀察結果,再進行血清免疫固定電泳結果判讀。

1.3.3流式細胞儀免疫表型檢查 取CD138-PE、CD38-FITC、CD19-PC7、CD56-PEcy5、CD117-PE、CD200-PE單克隆抗體各20 μL，加入流式細胞儀專用試管中備用。取2 mL采集好的肝素抗凝骨髓液，用PBS將其調制為(4～10)×106個/毫升的單細胞懸液，將100 μL單細胞懸液與20 μL組合好的抗體混合，室溫避光孵育20 min。加入氯化銨溶血劑待液體透亮，1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，加入0.5 mL PBS重懸后上機。以CD45/SSC配合CD38+/CD138+聯(lián)合設門，設定每管收集50 000個細胞，分析患者的骨髓細胞免疫表型。

1.3.4骨髓細胞形態(tài)學檢查 取0.2 mL采集好的肝素抗凝骨髓液，涂片后室溫晾干，用瑞氏-姬姆薩染液染色15 min，流水沖洗、晾干后，由有經驗的專職骨髓細胞形態(tài)學檢驗工作人員進行鏡檢。在染色良好推片的體尾交界處分類計數(shù)200個有核細胞，觀察骨髓瘤細胞形態(tài)和比例，以骨髓漿細胞≥10%并伴形態(tài)異常判定為陽性[4]。

2 結 果

2.1流式細胞術結果分析 每例骨髓標本經CD45/SSC設門后，將骨髓細胞劃分為淋巴細胞群、粒細胞群、單核細胞群、幼稚細胞群和骨髓瘤細胞群，再經CD38+/CD138+設門準確圈出骨髓瘤細胞。在本研究中，全部患者的骨髓瘤細胞占有核細胞的0.2%～52.9%，漿細胞約占有核細胞總數(shù)的9.7%，漿細胞免疫表型為CD38++(++代表強陽性)、CD138+、CD19-、CD56+、CD117-、CD200+，CD38和CD138都表現(xiàn)為陽性或強陽性，其余免疫表型的表達為陰性、部分陽性、陽性。血清免疫固定電泳分析結果顯示，在IgG、κ泳道發(fā)現(xiàn)異常單克隆條帶，表明單克隆免疫球蛋白類型為IgG-κ型。見圖1～2。

2.2MM患者細胞免疫表型分析 52例MM患者中，CD38和CD138的陽性率均為100.00%，其他免疫表型陽性率由高到低分別為CD56(80.77%)、CD117(40.38%)、CD200(26.92%)、CD19(9.62%)。

2.3兩種輕鏈型MM患者細胞免疫表型結果 患者的血清游離輕鏈檢查結果為κ鏈型27例,λ鏈型25例。在兩種輕鏈型MM患者細胞免疫表型結果中，κ鏈型患者CD56的陽性率比λ鏈型患者低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他抗原在兩種輕鏈型患者中表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩種輕鏈型MM患者細胞免疫表型陽性結果比較(n)

2.4不同類型免疫球蛋白MM患者細胞免疫表型結果 在不同類型免疫球蛋白MM患者細胞免疫表型結果中，CD56的陽性率在3種免疫球蛋白之間表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中IgG型最高(25/26)，其次是IgA型(14/15),IgM型最低(3/11)。其他免疫表型在3種免疫球蛋白之間表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。52例MM患者中有12例患者存在骨轉移瘤病變或病情進一步發(fā)展，在其免疫表型分析中發(fā)現(xiàn)有8例患者為CD19-CD56-，這8例CD56-患者中有7例患者為IgM-κ型。

表2 不同類型免疫球蛋白MM患者細胞免疫表型的比較[n(%)]

注：A為CD45/CD38設門找漿細胞；B為CD38++/CD19-找異常漿細胞；C為CD38++/CD56-找異常漿細胞；D、E分別為異常漿細胞表型表達CD117、CD200。圖1 1例MM患者骨髓流式細胞術分析散點圖

2.5骨髓細胞形態(tài)學檢查與流式細胞術檢測結果的相關性 應用流式細胞術檢測MM患者骨髓細胞，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞比例為0.2%～52.9%，骨髓細胞形態(tài)學檢查提示骨髓瘤細胞比例為2.0%～85.5%，可見骨髓細胞形態(tài)學計數(shù)檢查結果高于流式細胞術檢測結果,但兩種方法之間存在一定的相關性(R2=0.686 4,P<0.05)。見圖3。

注：SP為標準；G為IgG；A為IgA;M為IgM;κ為κ鏈型；λ為λ鏈型;箭頭所指處為異?？寺l帶。圖2 1例MM患者血清免疫固定電泳結果

圖3 骨髓細胞形態(tài)學檢查與流式細胞術結果的回歸曲線

3 討 論

目前臨床多采用DS分期對MM患者進行分期，根據(jù)β2-微球蛋白含量可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。對MM患者進行血清免疫固定電泳，可根據(jù)患者所分泌免疫球蛋白的類型，分為IgA、IgG、IgM、IgD、IgE、多克隆和不分泌型；還可根據(jù)伴隨單株免疫球蛋白輕鏈型分為λ鏈型和κ鏈型[5]。流式細胞術因具有快速、準確、客觀地檢測腫瘤漿細胞和正常漿細胞的免疫學特性的優(yōu)點，已成為MM診斷和分型的重要工具[3]，并可根據(jù)免疫表型(CD38、CD138、CD19、CD56、CD117、CD200)監(jiān)測患者病情發(fā)展及評估療效。

CD138是一種屬于硫酸肝素類家族的分子,目前被認為是漿細胞最特異的指標[6]，其也是最早用于流式細胞儀檢測骨髓瘤細胞的免疫表型[7]。本研究以CD45/SSC配合CD38+/CD138+聯(lián)合設門，分析骨髓細胞免疫表型的表達情況，結果顯示，CD38、CD138陽性率均為100%，與文獻[2，8]報道一致。

CD56是一種在腫瘤細胞之間、腫瘤細胞與成骨細胞之間調節(jié)同型細胞相互作用的黏附分子，是免疫球蛋白超家族中最先被發(fā)現(xiàn)的黏附分子，現(xiàn)已知CD56具有限制骨髓瘤髓外侵襲的作用，所以其與預后良好相關[9]，在正常漿細胞表面基本不表達，而在MM細胞表面高表達。CD56陰性的MM患者是一群特殊的疾病群體，患者具有更高的髓外病變發(fā)生率，臨床表現(xiàn)為原始漿細胞增多和腎功能損傷，總生存期明顯縮短，疾病更具侵襲性等。GUPTA等[10]指出，與CD56陽性MM患者相比，CD56陰性患者更易出現(xiàn)尿本周氏蛋白陽性和血小板減少、血漿β2-微球蛋白升高,多伴有腎功能異常、髓外浸潤,易發(fā)生貧血，病情進展快。有研究證明，在傳統(tǒng)化療方案治療的MM患者中，CD56陰性患者預后不良，且髓外的病變發(fā)生率較高[11]。蘇顯都等[6]在對47例MM患者的研究發(fā)現(xiàn)，CD56在不同的免疫球蛋白中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究結果顯示，CD56在不同類型免疫球蛋白之間表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中IgG型最高，其次是IgA型,IgM型最低；κ鏈型CD56陽性率低于λ鏈型(P<0.05)。這提示CD56的表達對不同類型免疫球蛋白的區(qū)分和輕鏈型的MM分型有一定的幫助。根據(jù)CD56陰性的患者髓外病變發(fā)生率較高這一特點，筆者推測κ鏈型比λ鏈型更容易發(fā)生髓外病變，而在克隆性免疫球蛋白分型中，IgM要比其他兩種類型免疫球蛋白更容易發(fā)生髓外病變。這可能也與不同的輕鏈型所分泌的免疫球蛋白不同有關。有研究發(fā)現(xiàn)，不同輕鏈型的MM患者存在免疫球蛋白定量水平的差異[12-13]。而免疫表型在腫瘤細胞中的表達除了受其分泌的免疫球蛋白影響外，還受患者性別、年齡、臨床分期等諸多因素的影響。因此，有關CD56的陰性表達可診斷MM和指導臨床治療這一結論還需進一步較大規(guī)模的研究確定。

在本研究中，應用流式細胞術檢測MM患者骨髓細胞，發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細胞比例為0.2%～52.9%，說明流式細胞術能將極微量的骨髓瘤細胞從復雜的細胞群中檢測出來，比細胞形態(tài)學計數(shù)更靈敏[14]。而每例患者的細胞形態(tài)學檢查骨髓瘤細胞結果都比流式細胞術檢測結果高，可能與流式細胞術設門方案和捕獲細胞數(shù)有關，也可能與漿細胞在骨髓分布中呈局灶性有關。同時，流式細胞術檢測時可能存在選擇性丟失漿細胞的問題，故骨髓漿細胞計數(shù)應以細胞形態(tài)學計數(shù)結果為準。由于每一個相關的免疫表型在骨髓瘤細胞上并非全部表達，可能存在缺失、錯譯、跨系表達的特點，這就要求在診斷MM時需要聯(lián)合多組抗體檢測來提高診斷的準確性，但目前國內還沒有一個統(tǒng)一的最優(yōu)的抗體組合方案。因此，骨髓細胞形態(tài)學檢查依然是診斷MM不可替代的重要手段[15]。

4 結 論

κ鏈型患者CD56的陽性率比λ鏈型低，CD56的陽性率在IgM型中最低。在篩選細胞方面，流式細胞術比細胞形態(tài)學更靈敏，但細胞形態(tài)學檢查的骨髓瘤細胞結果比流式細胞術結果更準確。