環(huán)介導等溫擴增法檢測人糞樣中美洲鉤蟲的方法建立

危芙蓉，朱慧慧，賈孝凱，汪俊云

鉤蟲是3種主要的土源性線蟲之一，寄生人體的鉤蟲主要由十二指腸溝口線蟲(AncylostomaDuodenaleDubini,1843)，簡稱十二指腸鉤蟲和美洲板口線蟲(NecatorAmericanusStiles，1902)，簡稱美洲鉤蟲。鉤蟲呈全球性分布，據(jù)估計有4億7 200萬人感染，造成400萬殘疾調(diào)整生命年(DALYs)[1]。 雖然我國鉤蟲感染率顯著下降，從1988-1992年全國人體寄生蟲分布調(diào)查時的17.17%，到2014-2016年全國人體重點寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查時的2.62%，但在人群土源性線蟲感染中，鉤蟲感染率明顯高于蛔蟲和鞭蟲[2]。因此，鉤蟲病是嚴重危害人們健康的重要公共衛(wèi)生問題。

對鉤蟲病的檢測目前極大依賴鏡檢法，該方法敏感度和特異度低，并依賴于檢測人員的鏡檢能力。而十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲蟲卵無法通過鏡檢法鑒別，需進一步孵化出鉤蚴以鑒別確診。然而，隨著防治工作的進展，鉤蟲病的感染率和感染度逐漸降低[2-3]，此法已難以應用于大規(guī)模監(jiān)測和流行病學調(diào)查。而免疫學法檢測的敏感性和特異性均存在局限，建立更敏感特異、簡便快速的鉤蟲病檢測方法是防治工作亟待解決的問題。核糖體轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列(ITS)在種內(nèi)具有高度保守性，而在種間顯示不同程度的差異，因此已應用于鉤蟲的分子檢測[4-6]。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)是近年發(fā)展起來的高效、簡便的DNA擴增技術(shù)[7]，近年來逐漸應用于糞便中病原體DNA的檢測[8-9]。本研究以美洲鉤蟲ITS序列為目標序列，通過軟件設計特異引物應用于LAMP擴增美洲鉤蟲ITS序列，并優(yōu)化擴增條件，對建立的LAMP方法評價其檢測的靈敏度和特異性，并應用現(xiàn)場樣本評價其檢測的敏感性和特異性，從而建立起以蟲卵為檢測材料的檢測美洲鉤蟲病的LAMP法，為美洲鉤蟲病提供特異、敏感、快速簡便的檢測方法，從而有助于我國鉤蟲病的防治。

1 材料與方法

1.1樣本來源 美洲鉤蟲蟲卵由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所藥物室提供。日本血吸蟲成蟲、鞭蟲成蟲、豬蛔蟲成蟲、蟯蟲成蟲由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所健教中心提供。人糞便樣本來自2017年四川省隆昌縣、安徽省桐城市現(xiàn)場監(jiān)測點，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所土食源室和安徽省桐城市血防所提供。新鮮的糞樣，經(jīng)改良加藤法鏡檢后，4 ℃保存，用于核酸提取。

1.2主要試劑 環(huán)介導等溫擴增試劑盒購于北京藍譜生物科技有限公司，常用DNA提取試劑盒和糞便DNA提取試劑盒均購于德國Qiagen公司，Taq聚合酶、DNA標記物均購于日本TaKaRa公司，瓊脂糖購自美國Promega公司，PCR儀(C1000TM Thermal Cycler)、電泳儀(PowerPac Basic)和凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Imager Gel Doc XR System)均為美國BioRad公司產(chǎn)品。

1.3DNA提取 寄生蟲樣本按照試劑盒的操作步驟操作。提取糞便DNA樣本時，在糞便樣品中加入少量0.1mm玻璃珠，經(jīng)高速震蕩混懸后，按照QlAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒的操作步驟操作。提取的DNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中美洲鉤蟲ITS基因(登錄號 LC036565.1)序列設計LAMP擴增引物，其中包括1對外引物(F3和B3)和1對內(nèi)引物(FIP和BIP)。F3：5′-TTCAATCGCAATGGCTTG-3′ B3：5′-CTCACATTGGGCTAAAAAGG-3′ FIP：5′-TCGACGATGATCCATCTGCAAACCGGGTAAAAGTCGTAAC-3′ BIP：5′-CATGATCTAGAGAAACCAACACGCGTGGTG-ATACTCCCAACTT-3′。并參照文獻[5]合成PCR引物，RTHW1F：5′-GATGAGCATTGCWTGAATGCCG-3′ RTHW1R：5′-GCAAGTRCCGTTCGACAAACAG-3′，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.5LAMP的敏感度和特異度評價 美洲鉤蟲DNA(濃度1 200 pg/mL)，按10倍稀釋為120 pg/mL、12 pg/mL、1.2 pg/mL、120 fg/mL、12 fg/mL、1.2 fg/mL和0.12 fg/mL后模板進行LAMP檢測。以日本血吸蟲、鞭蟲、豬蛔蟲、蟯蟲等DNA為模板，進行LAMP檢測方法，觀察是否存在交叉反應。

1.6LAMP檢測 反應體系為25 μL，取糞樣DNA 2.0 μL，依次加入12.5 μL 2×反應緩沖液、1.0 μL引物混合物(1.6 μmol/L的FIP和BIP、0.2 μmol/L的F3和B3)，1.0 μL Bst DNA聚合酶(8U)以及1.0 μL鈣黃綠素顯色劑，加無核酸酶水至總體積25 μL，充分混勻后將反應管置于63 ℃水浴孵育70 min。反應結(jié)束后，肉眼觀察各反應管的顏色，綠色為陽性，棕色為陰性。以美洲鉤蟲蟲卵DNA為陽性對照、無核酸酶水為陰性對照。

1.7PCR檢測及產(chǎn)物鑒定 25 μL PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP混合液(10 mmol/L)1 μL、正反向引物各1 μL(10 mmol/L)、Taq酶1 μL(5 U/μL)、DNA模板1 μL，加ddH2O至總體積25 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果登陸GenBank進行序列比對。

1.8統(tǒng)計學分析 計算LAMP相對鏡檢法和PCR法檢測美洲鉤蟲的敏感性和特異性。敏感性和特異性的計算公式如下：敏感性(%)=[真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))]×100%；特異性=[真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))]×100%。LAMP和PCR檢測結(jié)果，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對敏感性和特異性進行卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1LAMP檢測美洲鉤蟲靈敏度和特異度 已建立的LAMP法，與日本血吸蟲、鞭蟲、豬蛔蟲、蟯蟲、肺吸蟲均未見交叉反應。以美洲鉤蟲20條成蟲DNA為模板，按10倍稀釋為120 pg/mL、12 pg/mL、1.2 pg/mL、120 fg/mL、12 fg/mL、1.2 fg/mL和0.12 fg/mL后模板進行LAMP檢測，LAMP法可檢測出稀釋度為1.2 fg/mL的樣本，即極限D(zhuǎn)NA濃度為1.2 fg/mL，見圖1。

圖1 以美洲鉤蟲成蟲DNA為模板的LAMP法敏感性評價Fig.1 Sensitivity evaluation of LAMP method based on DNA of adult hookworm

2.2患者和健康人糞樣檢測結(jié)果 現(xiàn)場采集的糞便樣本，分別用Kato-Katz法、PCR法和LAMP法檢測美洲鉤蟲感染情況。將本研究建立的LAMP法分別與Kato-Katz法和PCR法檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，LAMP法相對Kato-Katz法的敏感性和特異性分別為95.24%和97.06%(見表1)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.5，P=0.479 5)。LAMP法相對PCR法的敏感性和特異性均為100%，無統(tǒng)計學差異(見表2，圖2)。

表1 LAMP法和鏡檢法檢測結(jié)果比較Tab.1 Comparison test between LAMP and Kato-Katz

表2 LAMP法和PCR法檢測結(jié)果比較Tab.2 Comparison test between LAMP and PCR

A：M為DNA標記物、P為陽性對照、N為陰性對照。1、3、4、6、8和9為PCR陽性的糞便樣本，2、5、7為PCR陰性的糞便樣本。B：P為陽性對照、N為陰性對照。1、3、4、6、8和9為LAMP陽性的糞便樣本，2、5、7為LAMP陰性的糞便樣本。圖2 PCR (A)和LAMP (B)檢測糞便樣本中美洲鉤蟲的結(jié)果Fig.2 Detection of N. Americanus of fecal samples by PCR (A) and LAMP (B), respectively

3 討 論

傳統(tǒng)的運用形態(tài)學方法鏡檢鉤蟲的手段，所需儀器設備相對簡單，但一方面要求檢測者具有較高的專業(yè)知識，需要通過長期的訓練達到較熟練的技術(shù)，與檢測者的經(jīng)驗存在較大關(guān)聯(lián)。另一方面對待檢樣本也有較高要求，首先要保證樣本的新鮮度，短時內(nèi)需要金策。同時，對于輕度感染患者，驅(qū)蟲后獲取的蟲體較少或蟲體破損等均會影響檢查者的判斷[10]。因此，傳統(tǒng)檢測方法在低感染率流行區(qū)做大規(guī)模流行病學篩查費時費力。隨著分子生物學技術(shù)發(fā)展，具有較高敏感度和特異度的檢測方法被應用于鉤蟲檢測中，如PCR技術(shù)[11]，彌補了形態(tài)學分類上的不足。進一步實時熒光定量PCR技術(shù)[12-13]，減少了原始PCR技術(shù)中對擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳觀察條帶步驟。但以上PCR技術(shù)必須在一定的實驗室條件下完成，對儀器設備有一定的要求。LAMP是一種新的核酸擴增方法，具有敏感、特異、簡易、快速等特點，無需高端儀器設備，可直接用肉眼觀察結(jié)果，已應用于病原檢測中。

本研究建立的LAMP法以檢測糞便中美洲鉤蟲蟲卵為目的，可有效檢測DNA濃度低至1.2 fg/mL的樣本，在目前感染率較低的國情下，降低了漏檢率，為篩查和治療提供了有效的診斷手段。在LAMP法與Kato-Katz法對比實驗中，出現(xiàn)Kato-Katz法陽性，而LAMP陰性的情況，原因可能是由于蟲卵在糞便中分布不均，隨機抽取糞樣時存在漏檢的情況。本研究中，Kato-Katz法一糞三檢，而LAMP法僅隨機抽取一份樣本，因此漏檢率顯著增高。然而在檢測樣本量降低2/3的情況下，LAMP法相對Kato-Katz法能達到極高的敏感性和特異性，說明了本研究中LAMP法具有較大的現(xiàn)場推廣價值。

為提高LAMP法的敏感度和特異度，可從以下2個方面避免假陰性和假陽性情況。第一，提高鉤蟲蟲卵DNA提取效率。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，由于美洲鉤蟲蟲卵卵殼具有一定的保護能力，因此DNA提取時需要采取措施破壁以釋放DNA。本實驗在糞樣中加入0.1 mm玻璃珠，經(jīng)高速震蕩后，按照試劑盒的手冊進行操作，可有效提取鉤蟲蟲卵DNA，提高檢出率。第二，減少污染以降低假陽性率的發(fā)生。基于LAMP法的高靈敏度，該法容易出現(xiàn)假陽性情況。正確的實驗操作手法，避免實驗試劑的污染。同時LAMP擴增反應結(jié)束后，避免打開反應管，有效避免氣溶膠污染實驗環(huán)境。

利益沖突：無