十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲鑒定方法研究進展

王旗 汪天平*

鉤蟲是一種土源性線蟲，蟲卵隨患者或帶蟲者排出的糞便在外界適宜的環(huán)境下發(fā)育成感染性的絲狀蚴，通過與人體皮膚接觸后而侵入人體完成感染。兩種鉤蟲的生活史基本相似，發(fā)育過程包括蟲卵、桿狀蚴、絲狀蚴、成蟲。從感染性的幼蟲侵入皮膚到成蟲產(chǎn)卵，一般約需要5～7周。每年5～10月份是鉤蟲感染的高發(fā)季節(jié)，鉤蟲的易感人群主要為經(jīng)常與泥土、農(nóng)作物接觸的農(nóng)民。鉤蟲病的流行與當?shù)氐纳a(chǎn)方式、生活方式，自然環(huán)境等多種因素有關(guān)[1]。本病主要存在于熱帶和亞熱帶經(jīng)濟欠發(fā)達的地區(qū)，被WHO列為被忽視的17種熱帶病之一[2]。2014～2016年，全國人體重點寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查顯示，我國的鉤蟲感染率約為1.12%[3]，兩種鉤蟲在我國地域分布有一定差異，南方以美洲鉤蟲為主，北方以十二指腸鉤蟲為主，其中混合感染較為普遍，主要存在于南北交界處[1]。兩種鉤蟲對驅(qū)蟲藥的敏感性也有一定的差異，阿苯達唑?qū)κ改c鉤蟲的治療效果要優(yōu)于美洲鉤蟲[4,5]，而三苯雙脒對美洲鉤蟲的治療效果要優(yōu)于十二指腸鉤蟲[6]。因此，進行感染人體的兩種主要鉤蟲的蟲種鑒定，對鉤蟲病的治療、防治具有十分重要的意義。

一、病原形態(tài)學鑒定

1.蟲卵

鉤蟲卵橢圓形，卵殼薄，無色透明，卵殼與卵細胞之間空隙明顯。從糞便中查到鉤蟲卵，是鉤蟲病確診的主要依據(jù)，常用的方法有直接涂片法、飽和鹽水浮聚法和改良加藤涂片法，目前在流行病學調(diào)查和實驗室診斷中，改良加藤法應用最為普遍[7]。但是十二指腸鉤蟲和美洲鉤蟲蟲卵形態(tài)相似，病原形態(tài)學檢測不易區(qū)別[7]。

2.幼蟲

將帶有鉤蟲卵的糞便通過試管濾紙培養(yǎng)法，經(jīng)過5～7 d兩種鉤蟲均能孵育出感染性的絲狀蚴[8]，此階段鉤蚴形態(tài)通過鏡檢可進行蟲種鑒定。在低倍鏡(×100)下，十二指腸鉤蚴蟲體細長，口矛不易見到，尾部鞘膜橫紋看不清；而美洲鉤蚴蟲體短粗，口矛易見，呈黑色短桿狀，尾部鞘膜橫紋可見[9]。高倍鏡(×400)下十二指腸鉤蚴口矛透明管狀，鞘膜橫紋少數(shù)可見，但不如美洲鉤蚴清楚；美洲鉤蚴口矛高倍鏡下更加清晰，黑色粗桿狀，尾部鞘膜橫紋清晰明顯[9]。此種方法耗時，費力，需要經(jīng)驗豐富的病原學專業(yè)技術(shù)人員能夠勝任。

3.成蟲

兩種鉤蟲成蟲蟲體形態(tài)區(qū)別最為明顯，成蟲主要通過內(nèi)鏡檢查或給患者驅(qū)蟲治療后從糞便獲取。在解剖鏡下觀察，十二指腸鉤蟲頭尾向背部彎曲，蟲體呈“C”形，口囊處有2對鉤齒，背輻肋遠端分2支，每支分3小支，交合刺呈長鬃狀，末端分開，有尾刺；美洲鉤蟲頭尾分別向背部和腹部彎曲，蟲體呈“S”形，口囊處有1對板齒，背輻肋基部分2支，每支再分2小支，交合刺合并成一刺，末端呈倒鉤狀，沒有尾刺[7]。

4.內(nèi)鏡檢查

近幾年，臨床上關(guān)于內(nèi)鏡檢查確診出鉤蟲感染的病例報道經(jīng)常出現(xiàn)。臨床上用于檢出鉤蟲病常用的內(nèi)鏡包括胃鏡、結(jié)腸鏡、雙氣囊小腸鏡、膠囊內(nèi)鏡等。內(nèi)鏡下蟲體呈淡紅色，半透明，體長約1 cm，通過鉤齒或板齒咬附于腸粘膜上，形成散在性的出血點及小潰瘍[10,11]。王聲旺等[12]通過對12例患者進行胃鏡檢查，胃十二指腸均未發(fā)現(xiàn)鉤蟲，排除上消化道疾病出血的可能。所有病例進行結(jié)腸鏡檢查，其中9例病患首次檢出鉤蟲，3例患者首次未檢出鉤蟲，但在做腸息肉治療時發(fā)現(xiàn)鉤蟲。李保安等[13]報道腸鏡檢出直腸鉤蟲感染1例，在行息肉手術(shù)后反復觀察，見活體寄生蟲1條咬附于直腸粘膜，取出送檢，經(jīng)檢驗科確診為十二指腸鉤蟲。Kshaunish等[14]對3例臨床表現(xiàn)為黑便的患者進行胃腸鏡檢查未見原發(fā)病灶，通過雙氣囊小腸鏡檢查，確診為鉤蟲感染。劉鑫等[15]通過對65例行雙氣囊小腸鏡檢查的可疑小腸病變患者臨床資料進行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，有兩例患者分別在空腸和回腸部位檢出鉤蟲。付唆林等[16]通過對1例反復臍周隱痛伴黑便4年的患者行雙氣囊小腸鏡檢查，在空腸中下段發(fā)現(xiàn)多條活動游走的鉤蟲蟲體。趙治彬等[17]對152例不明原因消化道出血行膠囊內(nèi)鏡檢查的患者進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)有鉤蟲病1例。陳敏佳等[18]通過使用膠囊內(nèi)鏡能夠清楚的觀察鉤蟲蟲體形態(tài)，腸內(nèi)活動及腸壁被咬附的創(chuàng)面。常江等[19]使用膠囊內(nèi)鏡發(fā)現(xiàn)十二指腸鉤蟲致消化道大出血病患1例，空腸上段見數(shù)條咬附著的鉤蟲，局部腸粘膜充血伴散在出血病灶。Christodoulou等[20]也報道了1例不明原因的消化道出血，后經(jīng)膠囊內(nèi)鏡診斷為鉤蟲病的患者。唐君瑞[21]通過對10例經(jīng)膠囊內(nèi)鏡診斷為小腸鉤蟲病患者的臨床資料進行回顧性分析，5例蟲體寄生于空腸，5例空腸回腸均有寄生。內(nèi)鏡檢查是臨床上鉤蟲病診斷重要的輔助工具，鑒別蟲種需要臨床醫(yī)師具備一定的病原學專業(yè)技能，對人員和設(shè)備要求比較高，不足之處在于，內(nèi)鏡檢查是一種侵入性操作，患者依從性，適應性較差[22]。

二、免疫學檢測

1.免疫應答水平變化

鉤蟲入侵宿主后并在宿主體內(nèi)移行，誘導宿主產(chǎn)生保護性免疫應答，宿主體內(nèi)重要的效應細胞，以及體液免疫產(chǎn)生一系列特異性的抗體都會顯著增加，主要表現(xiàn)為蟲體發(fā)育遲緩、存活數(shù)量的減少，以及成蟲生殖能力下降[23]。細胞免疫方面，Timothy等[24]發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)皮感染美洲鉤蟲后，白細胞顯著增多，感染10 d達到高峰，認為白細胞增多與幼蟲移行有關(guān)。Pritchard等[25]研究發(fā)現(xiàn)宿主感染美洲鉤蟲后嗜酸性粒細胞與蟲荷呈顯著負相關(guān)性，當再次感染后與IgE水平呈正相關(guān)性，因此認為美洲鉤蟲感染后Th2細胞可以產(chǎn)生保護性免疫應答。在體液免疫方面，王偉業(yè)等[26]發(fā)現(xiàn)小鼠感染十二指腸鉤蟲后，7 d血清出現(xiàn)抗體，15～30 d抗體水平達到高峰，45 d后抗體水平下降；小鼠感染美洲鉤蟲5 d血清中能檢出抗體，10 d達到高峰，15 d后抗體水平下降。結(jié)果表明美洲鉤蟲抗體血清中出現(xiàn)及達到高峰時間較十二指腸鉤蟲早，而十二指腸鉤蟲血清抗體持續(xù)時間較美洲鉤蟲長。Labiana等[27]發(fā)現(xiàn)美洲鉤蟲感染率隨年齡上升的趨勢比十二指腸鉤蟲明顯，兩種鉤蟲混合感染的地區(qū)，兒童階段感染率表現(xiàn)相對平緩。

2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA用于測定抗原或抗體，包括三個主要試劑：固相抗原或抗體；酶標抗原或抗體；酶反應底物。王偉業(yè)等[26]用美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲的幼蟲及成蟲制備可溶性抗原，應用ELISA法檢測感染宿主血清IgG抗體的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成蟲抗原的敏感性和特異性均高于幼蟲。Prichard DI等[28]發(fā)現(xiàn)相對分子量(Mr)在(28～33)×103的抗原組分為美洲鉤蟲所特有，與其他蠕蟲鑒別時敏感性很高。Prichard等[25]在1988～1990年分別在治療前后兩次對新幾內(nèi)亞Kebasob的202名村民采集血清，用ELISA法檢測抗美洲鉤蟲ES抗原的血清抗體水平，發(fā)現(xiàn)IgE水平和美洲鉤蟲的生殖力、蟲荷具有負相關(guān)性。

3.免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條法是一種固相免疫測定技術(shù)，原理與ELISA相似，最大的特點是不需要儀器設(shè)備，易操作，檢測快速，最常見的是免疫膠體金技術(shù)。石鋒等[29]以美洲鉤蟲成蟲的可溶性抗原作為包被抗原，用膠體金標記SPG作為檢測探針，成功建立了檢測美洲鉤蟲病特異抗體的免疫膠體金試紙條，該試紙條檢測美洲鉤蟲病人血清敏感性為88.4%，特異性達到94.9%，同時進行ELISA法檢測，二者在敏感性和特異性方面無顯著差異。

4.免疫沉淀和免疫印跡法

Carr等[30]制備美洲鉤蟲成蟲排泄分泌抗原，通過免疫沉淀法進行檢測發(fā)現(xiàn)，受美洲鉤蟲感染者血清對15×103、13×103、33×103、44×103、46×103抗原組分可發(fā)生沉淀反應。免疫印記法檢測受美洲鉤蟲感染的動物血清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可識別包括上述6種抗原組分在內(nèi)的至少15個蟲體抗原組分。其中33×103抗原組分為美洲鉤蟲所特有，十二指腸鉤蟲無此抗原。聞禮永等[31]通過SDS-PAGE和免疫印記技術(shù)對采集的十二指腸鉤蟲第三期幼蟲和成蟲的可溶性蛋白組分以及其免疫反應進行研究。幼蟲可溶性蛋白組分(Ad-L3-Ag)和成蟲可溶性蛋白組分(Ad-A-Ag)進行免疫印記反應結(jié)果顯示，十二指腸鉤蟲幼蟲特異性抗原組分為41×103，成蟲特異性抗原組分為55×103。

5.SDS-PAGE

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)主要用于蛋白和小片段核酸的分離。聞禮永等[31]通過SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，十二指腸鉤蟲幼蟲蛋白區(qū)帶為21條，成蟲蛋白區(qū)帶19條。Prichard等[28]通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)所有鉤蟲均含有(14～20)×103共同抗原組分，其中17×103為美洲鉤蟲所特有的抗原組分，具有種特異性。

三、分子生物學檢測

近幾年，分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應用，改變了鉤蟲傳統(tǒng)鑒定方法的局限性，具有高敏感性和高特異性的優(yōu)點。目前文獻報道常見的分子生物學檢測技術(shù)包括常規(guī)PCR、巢式PCR 與半巢式PCR、RT-PCR和HRM、LAMP技術(shù)、SSCP和PCR-RFLP等。

1.常規(guī)PCR

鄭琪等[32]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲mtDNA的CO1基因序列分別設(shè)計出兩條PCR擴增引物，對收集五個省份的鉤蟲成蟲CO1基因進行PCR擴增，結(jié)果顯示以美洲鉤蟲DNA為模板擴增出一條500bp左右的條帶，十二指腸鉤蟲DNA為模板進行擴增得到一條長700bp左右的條帶，然后進行序列比對和特異性檢驗，成功構(gòu)建了美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲蟲種鑒定的PCR檢測方法。Phosuk等[33]通過體外培養(yǎng)第三期鉤蚴，PCR擴增其核糖體DNA的全部5.8S、部分ITS-1和部分ITS-2序列，然后對PCR產(chǎn)物測序并比對，成功對美洲鉤蟲和十二指腸鉤蟲進行蟲種鑒定。

2.巢式PCR與半巢式PCR

巢式PCR又稱套式PCR，和常規(guī)PCR有所不同，巢式PCR需要兩對引物才能得到目的基因，第一對引物和常規(guī)PCR類似，第二對引物為巢式引物，需要用第一對引物PCR擴增的產(chǎn)物為模板再擴增，經(jīng)過兩輪PCR才能獲得的靶基因。半巢式PCR與巢式PCR基本相同，不同之處在于有一條外側(cè)引物為兩輪PCR共用引物。半巢式PCR比常規(guī)PCR具有更高的特異性和敏感性，在模板DNA含量很低時，也能很大程度提高DNA的產(chǎn)量[34]。劉曉輝[35]通過構(gòu)建套式PCR技術(shù)對人糞中存在的美洲鉤蟲和錫蘭鉤蟲進行分類鑒定，選取39份鉤蟲鏡檢陽性的糞便標本和21份鉤蟲鏡檢陰性的樣本，經(jīng)過套式PCR擴增，對產(chǎn)物進行序列比對，最終確定有1份與錫蘭鉤蟲的核糖體基因相似度在99%，49份與美洲鉤蟲核糖體基因相似度在99%，達到了對美洲鉤蟲和錫蘭鉤蟲的蟲種鑒定。De Gruijter等[36]利用半巢式PCR檢測人糞便中的十二指腸鉤蟲，與Verweij等[37]用半巢式PCR檢測人糞中的美洲鉤蟲作比較，進一步證實了用兩種鉤蟲特異性的引物進行PCR擴增，可以得到不同的目的基因，美洲鉤蟲電泳條帶大小約250bp，十二指腸鉤蟲約130bp，可以作為兩種鉤蟲分類鑒定的方法。

3.RT-PCR和HRM

實時熒光定量PCR(RT-PCR)可以對整個PCR反應過程實時監(jiān)測，通過反應曲線對核酸進行定量分析。Wang等[38,39]通過鉤蚴培養(yǎng)得到美洲鉤蟲幼蟲，提取幼蟲基因組DNA，對美洲鉤蟲ITS-2序列進行PCR擴增，對產(chǎn)物純化鑒定，作為標準模板建立了檢測美洲鉤蟲的RT-PCR標準曲線。高分辨率溶解曲線(HRM)分析技術(shù)是在RT-PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因檢測新技術(shù)，可以實時監(jiān)測熒光染料與雙鏈DNA從結(jié)合到釋放熒光強度的變化。對熒光強度和時間軸曲線分析進而對PCR產(chǎn)物進行鑒別。Ngui等[40]采用RT-PCR和HRM分析技術(shù)結(jié)合，以rDNA的ITS-2序列為靶基因，對人糞樣中5種鉤蟲進行RT-PCR檢測和溶解曲線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)美洲鉤蟲的HRM在不同溫度區(qū)間出現(xiàn)2個峰值，另外4種鉤蟲各在不同的溫度范圍出現(xiàn)一個峰值。

4.LAMP技術(shù)

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)是日本學者Notomi在2000年發(fā)明的一種新的DNA擴增技術(shù)，LAMP方法最大的特點是操作簡便，成本低，核酸擴增不需要PCR儀器，只需要水浴鍋就可以進行。Mugambi等[41]構(gòu)建了用于檢測糞便中美洲鉤蟲的LAMP診斷方法，對美洲鉤蟲的ITS-2序列設(shè)計了4個引物，LAMP法提取DNA，反應條件為63℃水浴1 h。結(jié)果顯示該引物只能擴增出美洲鉤蟲DNA片段，特異性為100%，因此該LAMP診斷方法可以對人糞中美洲鉤蟲進行鑒別。

5.SSCP和PCR-RFLP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)其原理是堿基突變時，單鏈DNA構(gòu)象發(fā)生改變，使其在凝膠電泳條帶上出現(xiàn)差異，呈多態(tài)性。Gasser等[42]通過核糖體DNA的ITS序列建立了PCR-SSCP技術(shù)，對PCR產(chǎn)物進行變性后凝膠電泳，結(jié)果證實可以鑒定所有的鉤蟲蟲種。限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術(shù),其原理是先用PCR擴增相應的DNA片斷，而后進行限制性內(nèi)切酶切反應，電泳后根據(jù)限制性圖譜來分析序列間的差異，最終能夠達到蟲種鑒定的目的。George等[43]利用半巢式PCR-RFLP方法對印度一個部落社區(qū)兒童進行鉤蟲病調(diào)查：41名兒童出現(xiàn)不同程度鉤蟲感染，美洲鉤蟲占95%，十二指腸鉤蟲15%，錫蘭鉤蟲5%。

四、小結(jié)

目前關(guān)于感染人體的兩種主要鉤蟲的分類鑒定檢測技術(shù)研究眾多，本文就近幾年文獻報道的最新分類鑒定方法進行了綜述。病原形態(tài)學鑒定方法操作費時費力，漏檢率高，僅在成蟲和絲狀蚴階段可以進行蟲種鑒定，而且需要檢查者具備豐富的經(jīng)驗，但此法卻是檢測鉤蟲和蟲種鑒別的最可靠標準。鉤蟲蟲種鑒定的免疫學診斷方法敏感性高，可以彌補病原形態(tài)檢測方法的不足，局限性在于抗原特異性不強，暫時沒有得到大規(guī)模應用，多用于確診的輔助手段。近幾年，分子生物學技術(shù)發(fā)展迅速，被廣泛應用到鉤蟲病的診斷以及蟲種的鑒定，具有高敏感性，高特異性的優(yōu)點，成為今后鉤蟲病研究的熱點檢測方法，但是需要相關(guān)儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員的分子生物學技能，目前在基層應用受到一定限制。三種檢測方法都存在一定的優(yōu)缺點，隨著科技的發(fā)展以及現(xiàn)代醫(yī)學的需要，分子生物學檢測對感染人體鉤蟲的鑒定應用前景更加廣闊。