ACE2在不同物種間的同源性分析及其對2019-nCoV宿主范圍的啟示

李彥君，陳嬌珊，趙 錦，聞子鈺，孫彩軍

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情暴發(fā)以來，在全球迅速蔓延，已造成超過410萬人感染。長期以來冠狀病毒家族成員與人類和動物疾病密切相關(guān)，可感染包括豬、牛、馬、駱駝、貓、狗、蝙蝠、兔子、雪貂、水貂、蛇、嚙齒動物、鳥類、和其他野生動物[1]。冠狀病毒科按其遺傳特性分為4個屬，其中α和β屬僅能感染哺乳動物，而γ和δ屬可感染禽類和哺乳動物等[1]。2019-nCoV 屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬[2]，近期的基因組學分析表明2019-nCoV 是一種自然進化的產(chǎn)物[3]。由于近期陸續(xù)報道了幾起動物的核酸檢測陽性事件[4-5]，2019-nCoV 由人向動物傳播的風險也引起了人們的關(guān)注。盡管尚缺乏確鑿的證據(jù)，但從理論上說這些動物與人類處于同一水平面對病毒，也有被感染的可能性[6]。基于2019-nCoV 已經(jīng)在人群廣泛流行，人類感染者是否能通過呼吸道等途徑再傳染給人類密切接觸的動物，造成該疾病成為長期存在的人獸共患病，這將是一個值得關(guān)注的科學問題。

人類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)包含805個氨基酸，由N端肽酶結(jié)構(gòu)域(peptidase domain，PD)和C端凝集素樣結(jié)構(gòu)域(collectrin-like domain，CLD)組成[7-8]。病毒表面S蛋白的受體結(jié)合域(receptor-binding domain, RBD)利用其外部區(qū)域與受體ACE2的PD結(jié)構(gòu)域(19-615殘基)結(jié)合，介導病毒進入宿主細胞[8-9]。同時ACE2在新冠肺炎的發(fā)病中也可通過對腎素-血管緊張素系統(tǒng)產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)，從而保護肺免受2019-nCoV所致的損傷[8,10]。因此，ACE2在COVID-19的傳播和疾病的病理中起關(guān)鍵作用。本文系統(tǒng)分析了不同物種ACE2蛋白的同源性，并討論了動物感染模型和潛在的易感動物，這將對實現(xiàn)人類-動物-生態(tài)的同一健康理念(One Health)以及預(yù)測預(yù)警重大疫情的流行和演變至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1研究對象 人類和30種與人類活動相對關(guān)系密切的動物ACE2全長氨基酸序列(1-805)。124種脊椎動物的ACE2-PD氨基酸序列(19-615殘基)。人類ACE2中與SARS-CoV接口的18個氨基酸：24Q、27T、31K、34H、37E、38D、41Y、42Q、45L、79L、82M、83Y、90N、325M、329F、330W、353L、354G[11]，人類ACE2中與2019-nCoV接口的8個氨基酸為24Q、30D、34H、41Y、42Q、82M、353L、357G[12]。

1.2數(shù)據(jù)來源與選擇 基于NCBI網(wǎng)站的Protein數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)，以“ACE2”為關(guān)鍵詞，篩選條件設(shè)置為：SPECIES 選擇“animals”，SOURCE DATABASES選擇“RefSeq”，下載不同物種ACE2氨基酸序列。124種脊椎動物中包含哺乳類75種、鳥類23種，魚類18種 爬行類7種和兩棲類1種。根據(jù)經(jīng)驗哺乳類動物與人類的同源性較高，進一步將其分為靈長目16種、奇/偶蹄目11種、食肉目23種、嚙齒目11種、翼手目7種、兔形目2種和其他類別8種。通過查閱文獻獲取人類ACE2中與SARS-CoV和2019-nCoV接口的20個氨基酸[11-12]。

1.3軟件和網(wǎng)站 氨基酸序列同源性比對使用NCBI網(wǎng)站的在線程序BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。采用MEGA 7軟件中的ClustalW 進行序列對齊，截取與人ACE2-PD 結(jié)構(gòu)域(19-615位殘基)的對應(yīng)序列。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建使用MEGA 7軟件，采用鄰接法(NJ，Neighbor-joining)，參數(shù)設(shè)置為 Bootstrap 1000個循環(huán)。使用在線程序iTOL(http://itol.embl.de/)修改樹枝和字體的顏色。

2 結(jié) 果

2.1不同物種間ACE2氨基酸全長序列對比 與人類活動相對關(guān)系密切的30種動物ACE2全長氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明(圖1)，相比于魚類、鳥類和爬行類動物，哺乳類動物間的ACE2同源性更高。21種哺乳類動物可主要分為2個分支，刺猬單獨為一類，人類、非人靈長類、食肉類、嚙齒類等動物為第二類。與人類并列的2個小類分別為：貓科動物、犬科動物、穿山甲構(gòu)成第一小類；奇蹄與偶蹄類動物和蝙蝠構(gòu)成第二小類。BLAST氨基酸序列對比顯示，與鳥類、魚類、兩棲動物和爬行動物相比，人類ACE2全長氨基酸序列與哺乳動物更相似，高達80%以上，其中大猩猩99%，獼猴97%。

2.2不同物種間ACE2-PD氨基酸序列對比 進一步擴大不同種類動物樣本的序列數(shù)據(jù)，納入了124種脊椎動物的ACE2氨基酸序列，分析與2019-nCoV病毒S蛋白結(jié)合的ACE2肽酶結(jié)構(gòu)域(ACE2-PD)序列的同源性。結(jié)果如圖2，PD結(jié)構(gòu)域序列在不同物種間的同源性分析結(jié)果大致與圖1中的ACE2全序列分析一致。值得注意的是，與ACE2全長序列分析相比較，圖2中貓科動物和反芻動物與人的識別率有所增加，而蝙蝠有所下降。

圖1 AEC2氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法，Bootsrtap1000個循環(huán)，n=31)Fig.1 Phylogenetic tree of AEC2 amino acid sequences (NJ method, Bootsrtap1000 cycles, n=31)

圖2 AEC2-PD結(jié)構(gòu)域氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法，Bootsrtap1000個循環(huán)，n=124)Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences in ACE2-PD domain (NJ method, Bootsrtap1000 cycles, n=124)

2.3不同物種間ACE2與S蛋白直接相互作用接口氨基酸對比 如表1，相對于人類ACE2的20個殘基，獼猴與人類完全一樣。家牛和家羊中的這20個殘基的變異性僅為3個氨基酸。家貓、雙峰駱駝和單峰駱駝中，在該位置有5個氨基酸的差異。蝙蝠的這20個氨基酸中有5個氨基酸與人類不同，而穿山甲的為7個。此外，家犬、野豬和家鼠在該位置的突變分別為6、6、8個氨基酸，而在禽類，如綠頭鴨、家雞以及羅非魚中的變異性均大于9個氨基酸。

表1 ACE2中與SARS-CoV及2019-nCoV RBD接口的20個氨基酸在不同物種中的保守性比較Tab.1 Comparison of conservation of 20 amino acids in ACE2 interface with SARS-CoV and 2019-nCoV RBD in different species

3 討 論

ACE2在動物界中廣泛表達，在哺乳動物中具有保守的一級結(jié)構(gòu)，ACE2的這種保守性可能反映了其在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的重要作用。ACE2受體與病毒S蛋白RBD直接作用的接口氨基酸中，除部分靈長類動物與人類完全相同外，其他物種均有一定程度的不同(表1)。然而先前的研究表明S蛋白RBD與ACE2相互作用可以“容忍”受體中一定程度的變異。例如，在與SARS-CoV病毒S蛋白RBD相互作用的18個ACE2殘基中，獼猴、倉鼠、貓的受體在該區(qū)域含有≤4個氨基酸的變異，但仍可被SARS-CoV所識別；而果子貍和浣熊ACE2受體中觀察到了大于7個氨基酸的替代，還可被SARS-CoV所識別[11]。

潛在的動物模型：非人靈長類動物與人類ACE2氨基酸全長序列以及ACE2-PD氨基酸序列的同源性最為接近，獼猴與人類ACE2的20個殘基完全一樣。這提示非人靈長類動物可以作為研究2019-nCoV的良好動物感染模型。事實上，靈長類動物模型如獼猴[13-15]、食蟹猴[16]，感染2019-nCoV顯示出與人類相似的癥狀，包括病毒載量的變化、肺部CT影像，研究者們已經(jīng)使用這些動物模型進行疫苗和藥物的篩選實驗[17]。氨基酸序列分析表明嚙齒類動物與人類同源性高，僅次于非人靈長類動物。小型嚙齒類動物具有容易飼養(yǎng)，維護成本低等優(yōu)點，是醫(yī)學研域最常用的模型。然而，2019-nCoV在大鼠和小鼠中的復(fù)制效率很低，可能是由于小鼠ACE2受體在353位含有賴氨酸到組氨酸的突變，導致缺乏賴氨酸殘基所產(chǎn)生的關(guān)鍵親水相互作用[11]；大鼠ACE2也含有這種K353H突變，并且在N82處具有潛在的N-糖基化位點，它消除了受體對SARS-CoV-S的結(jié)合能力[11]。我們的研究(表1)也表明家鼠在接口氨基酸突變較多(8個)，不太可能通過ACE2受體感染。值得關(guān)注的是，金黃色西伯利亞倉鼠模型[18]和人類ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型[19-20]已顯示出了希望的前景。

潛在的中間宿主：有文獻報道蝙蝠和穿山甲可能為2019-nCoV的中間宿主[21]，因為在這些動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與感染人類的2019-nCoV同源性很高(>95%)的冠狀病毒[2, 22]，但由于不能確定感染的時間順序，仍存在爭議。本文的研究顯示穿山甲的20個接口氨基酸中有7個與人類不同，變異性較大。以往的研究表明蝙蝠進化出了一些特殊的免疫機制，機體不會產(chǎn)生強烈的炎癥反應(yīng)以保證免疫系統(tǒng)不對病毒入侵采取過激反應(yīng)，以達到和多種病毒如埃博拉病毒、狂犬病病毒、MERS-CoV、SARE-CoV等和平相處的狀態(tài)，是多種病毒的儲存庫[23]。相比于ACE2氨基酸全長序列分析，蝙蝠與人的識別率在ACE2-PD結(jié)構(gòu)域序列分析中略有下降，20個接口氨基酸中蝙蝠有5個變異。因此，還需要提供更多證據(jù)來證明穿山甲和蝙蝠是否為2019-nCoV的中間宿主。

潛在的易感動物：我們的分析表明貓科動物和奇/偶蹄目動物與人類ACE2的一級結(jié)構(gòu)具有較高的同源性。在家貓，雙峰駱駝和單峰駱駝(中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)的宿主)中，接口氨基酸只有5個差異，從而提示這些動物有較大感染的可能性。最近，石正麗團隊調(diào)查了與人類密切接觸的動物和雪貂對2019-nCoV的敏感性，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV在狗、豬、雞和鴨中的復(fù)制能力很差，但在雪貂和貓中卻能有效復(fù)制，并可以通過呼吸道飛沫在貓之間傳播[4]。該團隊進一步檢測了武漢市COVID-19暴發(fā)后的102份貓血清樣本，表明在暴發(fā)期間已感染武漢的貓群，COVID-19患者擁有的3只貓的中和抗體滴度最高[5]。2020年4月6日美國農(nóng)業(yè)部動植物衛(wèi)生檢驗局確認動物園中一只圈養(yǎng)老虎2019-nCoV核酸檢測呈陽性，并出現(xiàn)干咳和食欲下降等癥狀。貓、雪貂、老虎同屬于貓科動物，可能是2019-nCoV的易感動物，這與我們的分析結(jié)果相吻合(表1)?？紤]到貓是與人類接觸非常密切的伴侶動物，因此應(yīng)該引起格外關(guān)注。同樣值得關(guān)注的是，在家牛和家羊中的這20個殘基的變異性僅為3個氨基酸，與Joana Damas等[24]的研究相符合，提示反芻動物可能也有利于2019-nCoV的跨物種傳播，然而目前的研究卻很少關(guān)注這類動物。因此，我們建議有關(guān)部門應(yīng)開展易感動物的病原學檢測。

其他動物：禽類，如綠頭鴨、家雞以及羅非魚中的變異性較大，提示與2019-nCoV病毒S蛋白的結(jié)合效率可能相對較低，因此這些家禽類動物感染此類病毒的可能性較低。

新冠病毒造成的全球大流行給人類健康和經(jīng)濟發(fā)展造成了巨大影響，目前仍無有效的特效藥物和預(yù)防性疫苗。不同物種間ACE2的同源性分析對建立2019-nCoV動物感染模型、跨物種傳播、保護潛在易感動物等提供理論依據(jù)。目前，已報了6種有希望的SARS-CoV-2動物感染模型，包括人ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠模型[19-20]、金黃色西伯利亞倉鼠模型[18]、雪貂模型[4, 25]、獼猴模型[13-15]和食蟹猴模型[16]等。這些動物模型的開發(fā)對于疫苗的評價和藥物的篩選至關(guān)重要。近年來暴發(fā)的一系列新發(fā)和再發(fā)人獸共患病，嚴重威脅著人類健康。然而，當前對于動物流行病學的常態(tài)化監(jiān)測和風險評估仍相對滯后。因此，積極推進動物流行病學分析，不僅有助于深刻理解病原體與不同物種間的關(guān)系從而為溯源工作奠定基礎(chǔ)，也將對建立人類-動物-生態(tài)的同一健康理念(One Health)的全方位新型公共衛(wèi)生防御體系具有重要的指導意義。

利益沖突：無