MRSA耐藥性檢測(cè)及SCCmec基因分型分析

屠雷鈞 葉永志 林 婭 邊保華

自1961年英國學(xué)者Jevons首先發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），隨后在世界各國陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一［1-3］。2012年中國醫(yī)院細(xì)菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，在我國MRSA感染在SA中所占比例達(dá)47.9%［4］。MRSA具有致病力強(qiáng)、傳播速度快、耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣的特點(diǎn)，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，其造成的感染與乙型肝炎、艾滋病并列成為世界三大難解決的感染性疾病之一［5］。MRSA的耐藥主要是因?yàn)槠咸亚蚓旧wmec基因盒（CSSmec）中攜帶甲氧西林耐藥決定子A（mecA）。且SCCmec型別較多，不同地區(qū)MRSA的SCCmec流行型別不同，其耐藥特性也有所不同。為了解本院住院患者M(jìn)RSA感染、SCCmec流行型別及耐藥特征，將臨床住院患者各類標(biāo)本中分離的金黃色葡萄球菌（SA）作MRSA檢測(cè)、基因分型及耐藥性分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 157株SA為臺(tái)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2018年1月至12月住院患者痰液、膿汁、血液、尿液等各種標(biāo)本分離所得，排除同一部位重復(fù)的菌株。

1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC43300（MRSA菌株）、金黃色葡萄球菌ATCC25923（MSSA菌株）均購自中國菌種保藏中心。

1.3 主要試劑與儀器 血平板、MH平板、5%羊血哥倫比亞瓊脂平板、MH肉湯等均為杭州天和微生物試劑公司產(chǎn)品；各種藥敏紙片均為英國Oxoid產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒為上海生工生物工程（股份）有限公司產(chǎn)品；VITEK-2Compact全自動(dòng)微生物分析儀和革蘭陽性細(xì)菌鑒定片為法國梅里埃公司產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀BIO-RAD S1000 Thermal cycle、凝膠電泳儀和成像系統(tǒng)均為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.4 方法 （1）SA的培養(yǎng)與鑒定：以《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離培養(yǎng)［6］，并經(jīng)法國梅里埃VITEK-2Compact型全自動(dòng)細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定。（2）MRSA表型檢測(cè)：采用頭孢西丁瓊脂擴(kuò)散法，操作方法及結(jié)果判斷按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）推薦的標(biāo)準(zhǔn)［7］。以金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC43300作質(zhì)控。（3）MRSA基因檢測(cè)：①M(fèi)RSA基因組DNA提取：采用上海生工生物工程（股份）有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。提取液質(zhì)量的檢測(cè)用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。②mecA及SCCmec基因分型檢測(cè)：引物設(shè)計(jì)：mecA及SCCmec基因擴(kuò)增引物委托上海生工生物工程（股份）有限公司合成。見表1和表2。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增體系及條件：PCR擴(kuò)增總體系均為50μl：dNTPs混合液（2.5mmol/L）4μl，10× 緩沖液 5μl，上下游引物（25μmmol/L）各1μl，Taq酶0.5μl，鎂離子0.5μl，DNA模板1μl，雙蒸餾水補(bǔ)足至50μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性 60s，55℃退火 60s，72℃延伸 60s，循環(huán)35個(gè)周期，最后72℃延長至10min。取PCR產(chǎn)物5 μl在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色紫外燈下成像，觀察分析結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增mecA基因引物序列

表2 PCR擴(kuò)增SCCmec基因引物序列

1.5 基因測(cè)序及分析 將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程（股份）有限公司純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Gen Bank序列數(shù)據(jù)庫中采用BLAST程序進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，確定基因型。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法，以CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作和結(jié)果判斷［7］，采用金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC43300作質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果

2.1 MRSA菌株表型檢測(cè)結(jié)果 157株分離自臨床各類標(biāo)本的SA經(jīng)表型檢測(cè)有76株陽性，初篩陽性率為48.41%。

2.2 MRSA菌株基因檢測(cè)及SCCmec分型結(jié)果 76初篩陽性的菌株，再經(jīng)PCR檢測(cè)mesA基因，電泳結(jié)果在147bp處有73株出現(xiàn)DNA陽性條帶，MRSA確證試驗(yàn)陽性率為46.50%。PCR電泳結(jié)果見圖1。73株確證為MRSA菌株經(jīng)PCR檢測(cè)SCCmec基因型，結(jié)果在280bp處出現(xiàn)41條DNA陽性條帶，在398bp處出現(xiàn)27條DNA陽性條帶，在200bp處出現(xiàn)2條DNA陽性條帶，尚有3株無法分型。PCR電泳結(jié)果見圖2。

圖1 mecA基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 SCCmec分型PCR基因擴(kuò)增電泳圖

2.3 基因序列測(cè)序結(jié)果 PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)純化測(cè)序，并與Gen Bank序列數(shù)據(jù)庫提供的SCCmec序列比對(duì)，結(jié)果確定200bp處陽性條帶為SCCmecⅣ型，280bp處為SCCmec型，398bp處為SCCmecⅡ型。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 SCCmecⅡ型與Ⅲ型對(duì)萬古霉素、替考拉寧具有極高敏感性，相反對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物100%耐藥，對(duì)其他常用抗菌藥物也有較高耐藥性，但SCCmecⅡ菌株耐藥率顯著低于SCCmecⅢ菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 主要MRSA菌株不同SCCmec基因型的耐藥結(jié)果（%）

3 討論

MRSA具有較強(qiáng)的致病力，且具有多重耐藥性的特點(diǎn)，備受臨床醫(yī)師高度關(guān)注。本資料結(jié)果顯示，MRSA表型檢測(cè)有76株陽性，初篩陽性率48.41%。由于MRSA產(chǎn)生的耐藥是因MRSA獲得mesA基因，mecA基因能編碼產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a），造成對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，CLSI明確指出一旦在金黃色葡萄球菌中檢測(cè)到mecA基因，即可認(rèn)定MRSA［8］。據(jù)此，采用PCR技術(shù)將76株表型陽性菌株經(jīng)mecA特異性檢測(cè)，結(jié)果有73株P(guān)CR反應(yīng)擴(kuò)增到147bpDNA片段，MRSA確證陽性率為46.50%，該結(jié)果與2012年中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)所監(jiān)測(cè)的全國MRSA平均檢出率47.9%基本相一致［5］，高于應(yīng)建飛報(bào)道的37.28%［9］，表型與基因型檢測(cè)符合率為96.05%。另3株表型檢測(cè)雖然陽性，能表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶，但菌株未攜帶mecA基因，其原因據(jù)學(xué)者報(bào)道認(rèn)為一旦SA細(xì)胞壁增厚變粗也能導(dǎo)致表型陽性而對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥［10］。

SCCmec是一個(gè)能移動(dòng)的遺傳基因元件，由mecA等多種基因構(gòu)成，還攜帶有多種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子，編碼除對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥外，還能編碼產(chǎn)生對(duì)多種抗菌藥物耐藥。依據(jù)SCCmec盒上基因復(fù)合體的組成不同，SCCmec有多種型別，SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型主要見于醫(yī)院感染獲得性MRSA（HA-MRSA），SCCmecⅣ、Ⅴ型主要見于社區(qū)獲得性MRSA（CAMRSA）。這幾年又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他新的型別SCCmec。SCCmecⅠ型是最早發(fā)現(xiàn)，所帶耐藥基因少，大多數(shù)對(duì)非β-內(nèi)酰胺類藥物敏感。SCCmecⅡ、Ⅲ型含耐藥基因比Ⅰ型要多，且多種耐藥基因整合在一起，表現(xiàn)為對(duì)多種抗菌藥物耐藥。相對(duì)SCCmecⅢ型要比Ⅱ型攜帶耐藥基因更多，故其耐藥性更強(qiáng)更廣些。SCCmecⅣ、Ⅴ型分子較小，且基因較穩(wěn)定，僅攜帶mecA基因，不帶有其他耐藥基因［11］，因此，對(duì)非β-內(nèi)酰胺抗生素大多敏感。不同型別SCCmec在不同國家和不同地區(qū)流行也不相同，亞洲地區(qū)MRSA流行型別以SCCmecⅡ型為主，在我國南北地區(qū)流行菌株的基因型也有差異，北方對(duì)SCCmecⅡ型為主，而南方則以SCCmecⅢ型為主［12］。本資料結(jié)果顯示，本組MRSA流行菌株主要是SCCmecⅢ型，由于SCCmecⅢ型攜帶有更多的耐藥基因整合在一起，還可通過質(zhì)粒等途徑在葡萄球菌間傳播而造成多重耐藥，應(yīng)引起臨床醫(yī)師高度關(guān)注。

SCCmecⅡ型與Ⅲ型對(duì)萬古霉素、替考拉寧具有極高敏感性，未見耐藥菌株，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物100%耐藥，對(duì)其他抗菌藥物也有較高耐藥性，但SCCmecⅡ型菌株對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類、四環(huán)素類和林可霉素類的耐藥性顯著低于SCCmecⅢ型菌株。表明SCCmecⅢ型菌株比Ⅱ型菌株攜帶有更多的耐藥基因整合在一起，且mecA基因與其耐藥基因緊密相鄰而連鎖，造成更為嚴(yán)重耐藥。利奈唑胺對(duì)MRSA具有很高敏感性，極少見到耐藥報(bào)道，但在本資料中尚有1株SCCmecⅢ型菌株產(chǎn)生耐藥，據(jù)報(bào)道可能與23S核糖體RNA 突變或cfr基因介導(dǎo)的2503位腺嘌呤甲基化有關(guān)［13］，有待今后工作中進(jìn)一步加以研究。

了解MRSA在臨床感染率及SCCmec基因型在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r，對(duì)防控MRSA菌株在院內(nèi)流行及耐藥性分析具有重要意義。