結(jié)腸癌組織中miR-21、C-met的表達(dá)及臨床意義

劉杰 張文天 杜錦波

[摘要] 目的 探究結(jié)腸癌組織中微小RNA（miR）-21和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（C-met）的表達(dá)情況及臨床意義。方法 回顧性分析2017年2月～2019年5月河北省滄州市人民醫(yī)院收治的95例結(jié)腸癌患者的病理及臨床資料。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)miR-21和C-met在結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)量并比較分析其與臨床病理的聯(lián)系，分析癌組織中miR-21和C-met的相關(guān)性。 結(jié)果 結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達(dá)量均高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織（P < 0.05）。結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05）。結(jié)腸癌組織中miR-21的表達(dá)量和C-met的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r = 0.832，P = 0.000）。 結(jié)論 結(jié)腸癌組織中C-met和miR-21的表達(dá)均上調(diào)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)，二者均可能成為評(píng)估病情嚴(yán)重程度及預(yù)后情況的潛在標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌;微小RNA-21;肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體;相關(guān)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）06（b）-0121-04

Expression and clinical significance of miR-21 and C-met in colon cancer

LIU Jie? ?ZHANG Wentian? ?DU Jinbo

Department of Gastrointestinal Surgery， Cangzhou People′s Hospital， Hebei Province， Cangzhou? ?061000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of microRNA（miR）-21 and hepatocyte growth factor receptor（C-met） in colon cancer tissues. Methods The pathological and clinical data of 95 cases with colon cancer who admitted to Cangzhou People′s Hospital of Hebei Province from February 2017 to May 2019 were analyzed retrospectively. Quantitative real-time PCR was used to quantitatively detect the expression levels of miR-21 and C-met in colon cancer tissues and adjacent normal tissues， and their correlation with clinicopathology were analyzed， and the correlation between miR-21 and C-met in cancer tissues was analyzed. Results The expressions of miR-21 and C-met in colon cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expressions of miR-21 and C-met in colon cancer tissues were related to TNM stage， lymph node metastasis and vascular cancer embolus （P < 0.05）. There was a significant positive correlation between miR-21 expression and C-met expression in colon cancer tissues （r = 0.832， P = 0.000 ）. Conclusion The expressions of C-met and miR-21 in colon cancer tissues are both up-regulated， and are associated with TNM stage， lymph node metastasis and vascular cancer embolus， which may be potential markers for assessing the severity of the disease and prognosis.

[Key words] Colon cancer; MicroRNA-21; Hepatocyte growth factor receptor; Correlation

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的腸道惡性腫瘤，其在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重危害人們的生活質(zhì)量及生命安全。由于結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)腫瘤已進(jìn)展到中晚期[1]，因此深入探尋結(jié)腸癌發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制，明確癌變過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)早期診斷和靶向藥物研發(fā)意義重大。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)、組織分化以及細(xì)胞周期等生命活動(dòng)[2]。miR-21位于染色體17q23.1，其作用類(lèi)似于原癌基因，通過(guò)參與調(diào)控細(xì)胞周期和基因表達(dá)等過(guò)程促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展[3]。相關(guān)研究報(bào)道[4]，miR-21能夠抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)控Ras/MEK/ERK途徑，進(jìn)而促進(jìn)癌癥的發(fā)生與進(jìn)展。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（C-met）是由原癌基因編碼生成的跨膜蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞骨架重排及信息傳導(dǎo)途徑，在癌細(xì)胞增殖、分化、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。既往研究顯示[6]，C-met蛋白可激活酪氨酸激酶，進(jìn)而影響信號(hào)傳導(dǎo)通路及其酶促反應(yīng)，與多種癌基因產(chǎn)物關(guān)系密切，在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)。本研究探討miR-21和C-met在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量及臨床意義，同時(shí)分析二者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年2月～2019年5月河北省滄州市人民醫(yī)院收治的95例結(jié)腸癌患者的病理及臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《結(jié)腸癌規(guī)范化診療指南（試行）》[7]標(biāo)準(zhǔn)且結(jié)腸鏡及術(shù)后病理診斷為結(jié)腸癌;②患者臨床資料齊全，且自愿配合本研究;③均為首次診斷，且既往無(wú)放化療史和腸道手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腸道惡性腫瘤或嚴(yán)重疾病者;②伴有肝腎功能?chē)?yán)重下降而不宜手術(shù)者;③患有先天遺傳性疾病或免疫系統(tǒng)異常者。

本研究共納入研究對(duì)象95例，其中男51例，女44例;平均年齡（57.34±9.61）歲;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者81例;腫瘤直徑≤5 cm者47例，腫瘤直徑>5 cm者48例;高分化者65例，中分化者23例，低分化者7例;TNMⅠ期31例，Ⅱ期44例，Ⅲ期15例，Ⅳ期5例;有脈管癌栓者16例，無(wú)脈管癌栓者79例;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者19例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者76例。

1.2 方法

miR-21和C-met的表達(dá)量采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)。術(shù)中分別取結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常結(jié)腸組織（距病灶10 cm處），統(tǒng)一暫存于液氮中，術(shù)后立即轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中。腫瘤直徑通過(guò)卡尺測(cè)得。兩種組織均取100 mg，研磨后均加入1 mL Trizol試劑（購(gòu)自Invitrogen公司，生產(chǎn)批號(hào)：20161001）提取總RNA。將20 μg總RNA通過(guò)ImProm-ⅡTM Reverse Transcriptase（購(gòu)自Promega 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20170122）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-21和C-met的表達(dá)量通過(guò)SYBR ExTaq Mix試劑盒（購(gòu)自TaKaRa 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20161213）定量檢測(cè)。miR-21和C-met的反應(yīng)條件均為42℃ 60 min，70℃ 15 min。二者PCR反應(yīng)體系為10 μL SYBR ExTaq Mix、0.4 μL PCR Forward Primer、0.4 μL PCR Reverse Primer、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、2.0 μL cDNA template以及6.8 μL RNase free dH2O，共計(jì)20 μL。miR-21上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGA-CTGA-3′、下游引物序列為5′-TGGTGCGTGGAGTC-G-3′，內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3′、反向引物序列為5′-AACGCTTA-CGAATTTGCGT-3′;C-met正向引物序列為5′-GAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′、反向引物序列為5′-G-ATGATTCCCTCGGTCAGAA-3′，內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列為5′-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3′、反向引物序列為5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。C-met的PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 min，變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s;而miR-21的PCR反應(yīng)條件為95℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火及延伸60℃ 60 s，二者均為40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均進(jìn)行3次檢測(cè)。所有引物均由上海生工公司負(fù)責(zé)合成。所有樣品均用相對(duì)Ct值法評(píng)估，結(jié)果以ΔCt值表示，miR-21和C-met的表達(dá)量分別相對(duì)于U6和GAPDH的比值為2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中miR-21和C-met的表達(dá)量比較

結(jié)腸癌組織miR-21和C-met表達(dá)量均高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織（均P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達(dá)量與臨床病理的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達(dá)量與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05），與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無(wú)關(guān)（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met表達(dá)的相關(guān)性分析

結(jié)腸癌組織中miR-21的表達(dá)量和C-met的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（r = 0.832，P = 0.000）。見(jiàn)圖1。

3 討論

結(jié)腸癌屬于高度惡性的腸道腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第三位，而死亡率居第二位，對(duì)人類(lèi)健康造成巨大威脅[8]。近年來(lái)，由于生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率仍不斷提高，且呈顯著地域性差異[9]。結(jié)腸癌的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜且漫長(zhǎng)的過(guò)程，是多因素、多階段及多基因共同作用的結(jié)果，其中以抑癌基因失活和原癌基因激活尤為關(guān)鍵[10]。目前，臨床主要采用手術(shù)為主、化療為輔的治療方式，但由于結(jié)腸癌毗鄰器官較多、周?chē)┖土馨拖到y(tǒng)豐富，易于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵犯周?chē)鞴?，因此療效較差，患者復(fù)發(fā)率和死亡率較高。表觀(guān)遺傳學(xué)是結(jié)腸癌近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，有望為結(jié)腸癌的早期診斷、預(yù)防以及評(píng)估預(yù)后提供有力證據(jù)。既往研究顯示[11-12]，DNA甲基化、非編碼RNA、組蛋白修飾以及DNA磷酸化均在腫瘤易感性及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，使環(huán)境介導(dǎo)基因表型改變，進(jìn)而造成基因表達(dá)多樣性，最終提高正常細(xì)胞演變?yōu)榘┘?xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。

miRNA是高度保守的非編碼RNA，主要位于內(nèi)含子或基因間隔區(qū)，其表達(dá)具有組織和時(shí)序特異性。研究顯示[14]，miR-21具有致癌作用，在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。此外，miR-21通過(guò)作用其靶點(diǎn)PDCD4和抑制凋亡蛋白2，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞不斷增殖、分化及侵襲，同時(shí)，也有助于提高癌細(xì)胞的耐藥性[14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-21的表達(dá)量高于對(duì)應(yīng)癌旁組織（P < 0.05），其機(jī)制可能為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）MEG3能夠負(fù)性調(diào)控miR-21的表達(dá)有關(guān)。在正常細(xì)胞中，LncRNA MEG3自身可以作為分子海綿，通過(guò)結(jié)合miR-21抑制其表達(dá)，然而在腫瘤細(xì)胞中LncRNA MEG3表達(dá)下調(diào)，使抑制miR-21的作用減弱，從而使miR-21上調(diào)[15]。結(jié)腸癌組織中miR-21的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05），且惡性度越高，miR-21表達(dá)量越高。其機(jī)制可能為癌組織中的miR-21激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，調(diào)節(jié)病灶周?chē)仔苑磻?yīng)，同時(shí)誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低E-鈣黏素，使其分化程度降低并促進(jìn)轉(zhuǎn)移[16]。miR-21能夠抑制BTG2、NEDD4L以及PDCD4等抑癌基因發(fā)揮作用，且促進(jìn)原癌基因表達(dá)，從而刺激癌細(xì)胞分化和增殖[14]。此外，miR-21能夠誘導(dǎo)侵襲因子基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，使腫瘤的惡性度增加[16]。

C-met又稱(chēng)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，位于細(xì)胞膜骨架上，包含兩種亞基（α和β）和一個(gè)酪氨酸激酶區(qū)，具有酪氨酸激酶活性[17]。C-met通過(guò)結(jié)合肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）使自身磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)其他底物蛋白磷酸化，激活3-磷脂酰肌醇激酶途徑和有絲分裂原活化蛋白激酶途徑，使HGF活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖及分化[18]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中C-met的表達(dá)量高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織（P < 0.05）。其機(jī)制可能為癌組織中過(guò)度表達(dá)的HGF結(jié)合C-met，激活酪氨酸激酶，使其催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的酪氨酸酶（Tyr）1234和Tyr1235發(fā)生磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而增加C-met的生物活性，使C-met表達(dá)提高[19]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中C-met的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05），且惡性度越高，C-met表達(dá)量越高。其原因可能是活化的C-met能夠激活黏附分子并重排細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，同時(shí)，MMP被激活，從而降解部分細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞向周?chē)M織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[20-21]。同時(shí)，C-met通過(guò)自體磷酸化促進(jìn)磷脂酶、Ras蛋白以及接頭蛋白Gab1等蛋白的酪氨酸磷酸化，逐步形成級(jí)聯(lián)化的磷酸化反應(yīng)，將放大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，從而使癌細(xì)胞增殖和分化能力增強(qiáng)[17]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中的C-met表達(dá)量和miR-21表達(dá)量呈顯著正相關(guān)（P < 0.05），提示C-met和miR-21可能都具有促進(jìn)癌癥進(jìn)展的功能，且miR-21可能與C-met互為協(xié)同作用，共同加速結(jié)腸癌的發(fā)生及進(jìn)展。盡管目前無(wú)研究顯示二者作用的具體機(jī)制，但C-met和miR-21均可作用于RAS/ERK信號(hào)通路，增強(qiáng)癌細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，間接反映了二者可能通過(guò)該信號(hào)通路起到互相協(xié)同的作用[4，17]。然而，本研究樣本量有限，C-met和miR-21之間的作用機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中C-met和miR-21的表達(dá)均上調(diào)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)，可能是評(píng)估病情嚴(yán)重程度及預(yù)后情況的潛在標(biāo)志物。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 賈俊婷，柴麗敏，郝志英.重組高密度脂蛋白-紫杉醇對(duì)結(jié)腸癌的靶向性研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2019，39（2）：161-164.

[2]? 王小東，馬博昭，戚峰.MiR-148a-3p通過(guò)靶向SRPK2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，25（2）：99-104，109.

[3]? 姚麗華，汪光蓉，蔡燕，等.miR-18a和miR-21在食管癌中的表達(dá)及其對(duì)食管癌的診斷價(jià)值[J].中華腫瘤雜志，2019，41（2）：107-111.

[4]? 韋皓棠，王佳雷，倪敏，等.miR-21的功能分析及其在結(jié)腸癌中的臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，201，27（1）：104-107.

[5]? 方瑜，王琳，李桂梅，等.c-Met、VEGF、EGFR和HER-2在A(yíng)FP陽(yáng)性胃癌中的表達(dá)研究[J].中國(guó)癌癥雜志，2016， 26（8）：662-669.

[6]? 駱婕，郭妹，吳瑾柔，等.結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子-1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和C-met信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2019，35（6）：924-927.

[7]? 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).結(jié)腸癌規(guī)范化診療指南（試行）[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版，2013，5（8）：47-51.

[8]? 鐘秀宏，王月華，蔣林哲，等.結(jié)腸癌早期診斷及預(yù)防措施[J].中國(guó)慢性病預(yù)防與控制，2019，27（5）：387-390.

[9]? 魏琳琳，張娜，郭紅，等.長(zhǎng)鏈非編碼RNA DLX6-AS1在結(jié)腸癌組織與細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2019，27（13）：2349-2353.

[10]? 廖述文，楊平，張通，等.藤黃酸對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響[J].國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，2014，36（3）：220-222.

[11]? 錢(qián)偉明，王海燕，李可.結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白表達(dá)與基因甲基化狀態(tài)變化及其臨床意義[J].山東醫(yī)藥，2019，59（19）：10-13.

[12]? 劉鋒瑞，劉亞娟，高紅艷，等.絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（SHMT2）調(diào)控AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2019，35（4）：344-350，356.

[13]? 王金龍，劉芳曉，趙燕云，等.前列腺癌組織中具有潛在生物標(biāo)記物特性的miRNA及其靶基因生物學(xué)功能、信號(hào)通路分析[J].山東醫(yī)藥，2019，59（6）：9-12.

[14]? Saxena A，Shoeb M，Ramana KV，et al. Aldose reductase inhibition suppresses colon cancer cell viability by modulating microRNA-21 mediated programmed cell death 4（PDCD4）expression [J]. Eur J Cancer，2013，49（15）：3311-3319.

[15]? 范寧寧，耿敬姝.長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)及作用研究[J].實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2018， 32（3）：219-223.

[16]? Du Q，Zhang X，Zhang X，et al. Propofol inhibits proliferation and epithelial-mesenchymal transition of MCF-7 cells by suppressing miR-21 expression [J]. Artif Cells Nanomed Biotechnol，2019，47（1）：1265-1271.

[17]? 孫厚良，江秀娟，梅學(xué)英，等.MACC1基因和c-Met蛋白在宮頸癌中的表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（6）：2720-2725.

[18]? 秦建領(lǐng)，秦名揚(yáng).結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子1和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2017，45（4）：56-58.

[19]? Li MY，Liu Y，Liu LZ，et al. Estrogen receptor alpha promotes smoking-carcinogen-induced lung carcinogenesis via cytochrome P450 1B1 [J]. J Mol Med （Berl），2015， 93（11）：1221-1233.

[20]? 馬桂芳，蔡紅星，丁鳳云，等.胃癌組織中c-Met的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2013，20（5）：603-608.

[21]? 李琳，付堯，吳鴻雁，等.胃腺癌中c-MET、EGFR和HER-2的表達(dá)及其與臨床病理特征的分析[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2019，35（1）：6-10.

（收稿日期：2019-11-13? 本文編輯：劉明玉）