青年兔與老年兔甲杓肌及環(huán)杓后肌組織結(jié)構(gòu)比較△

李翠娥 史艷莉 孫曉玲 周濤 詹娜

據(jù)聯(lián)合國(guó)報(bào)道，2017年65歲以上的老年人口約占世界總?cè)丝诘?%，到2050年將達(dá)到16%[1]。據(jù)估計(jì)，約12%～29%的老年人有嗓音障礙[2]，而其中約10%為老年嗓音(presbyphonia)[3]。老年嗓音是指由于喉的老化引起的嗓音年齡相關(guān)性變化，患者通常會(huì)抱怨聲音粗糙度增加，聲音不穩(wěn)定，發(fā)聲持續(xù)時(shí)間縮短以及語音質(zhì)量下降，男性患者嗓音更加尖銳，女性患者的聲音則會(huì)相對(duì)變低沉，并且在嘈雜的環(huán)境中，很難讓交流對(duì)象感知聲音信息[4,5]；老年人嗓音音質(zhì)的這些變化，可能使其感到焦慮和沮喪，甚至回避參與社會(huì)活動(dòng)[6]；因而，老年人的語音問題逐漸成為嗓音工作者的一個(gè)新挑戰(zhàn)。為了尋求預(yù)防和治療老年嗓音的有效方法，學(xué)者們借助大鼠、豚鼠、狗、兔等動(dòng)物進(jìn)行了很多研究，其中，就組織的相近程度而言，兔的喉組織結(jié)構(gòu)與人類最接近[7,8]，兔喉非常適用于人喉功能研究；且既往研究證實(shí)，老齡哺乳動(dòng)物的喉內(nèi)肌發(fā)生了許多老化改變，故本研究擬通過比較青年兔與老年兔喉內(nèi)肌中的甲杓肌(posterior cricoarytenoid muscle，PCA)及環(huán)杓側(cè)肌(thyroarytenoid muscle，TA)組織結(jié)構(gòu)變化，探討喉內(nèi)肌在老年嗓音發(fā)生機(jī)制中的可能作用，為老年嗓音的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康8月齡雄性大白兔5只作為青年組，體重1.5～2 kg，自然衰老的30月齡雄性大白兔5只作為老年組，體重2.5～3.5 kg。所有動(dòng)物均購(gòu)自湖北逸摯誠(chéng)生物科技有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2甲杓肌和環(huán)杓后肌取材 動(dòng)物腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(10 mg/kg)全麻后，立即取出喉部，分離雙側(cè)甲杓肌和環(huán)杓后肌，將一側(cè)甲杓肌及環(huán)杓側(cè)肌在液氮中快速冷凍，將另一側(cè)甲杓肌及環(huán)杓側(cè)肌置于2.5%戊二醛中固定。

1.3甲杓肌及環(huán)杓后肌肌纖維橫截面積和直徑的測(cè)量以及肌纖維計(jì)數(shù) 用-20 ℃恒冷箱切片機(jī)將冷凍的甲杓肌及環(huán)杓側(cè)肌切片(橫切面)，片厚12 μm，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察環(huán)杓后肌和甲杓肌肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)，選擇各組TA和PCA染色較好的切片各3張，采用日本LUZEX-F圖像分析儀，測(cè)量肌纖維的橫截面積和直徑，每張切片選30個(gè)細(xì)胞，計(jì)算均數(shù)；每張切片選取不重疊的3個(gè)視野進(jìn)行肌纖維計(jì)數(shù)，取均數(shù)。

1.4透射電鏡觀察甲杓肌及環(huán)杓后肌的超微結(jié)構(gòu) 取出固定于2.5%戊二醛中的甲杓肌及環(huán)杓側(cè)肌，PBS緩沖液洗脫3次，3分鐘/次，1%鋨酸固定20～30分鐘，PBS緩沖液洗脫1次，脫水(50%、70%、80%、90%乙醇各5分鐘，1次；100%乙醇4分鐘，3次；100%丙酮3分鐘，2次)，1∶1丙酮+環(huán)氧樹脂半浸透，40度2 h，純環(huán)氧樹脂全浸透，40度，3.5 h；最后聚合，40度6 h，65度6 h,100度48 h。采用Hitach HT7700(日本日立公司)透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)觀察肌纖維的超微結(jié)構(gòu)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用非配對(duì)資料t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1青年兔和老年兔甲杓肌和環(huán)杓后肌肌纖維的橫截面積、直徑和計(jì)數(shù)比較 光學(xué)顯微鏡下，青年兔甲杓肌和環(huán)杓后肌的肌纖維均呈規(guī)則的平行排列，橫紋清晰，肌漿染色后呈現(xiàn)紅色，核呈藍(lán)色，肌纖維的橫斷面大多呈多角形，肌束清晰，肌纖維間結(jié)締組織少(圖1)。老年兔的肌纖維則排列較松散，橫紋稍少且不清晰，肌漿著色較深，橫斷面呈多角形，肌束輪廓不甚清晰，肌纖維間結(jié)締組織較青年兔增多(圖2)。

青年兔和老年兔甲杓肌和環(huán)杓后肌的橫截面積、直徑和計(jì)數(shù)見表1，可見，老年兔甲杓肌的橫截面積和肌纖維計(jì)數(shù)較青年兔縮小或減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；老年兔環(huán)杓后肌的橫截面積、直徑及肌纖維計(jì)數(shù)雖也有所縮小或減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 青年兔和老年兔甲杓肌和環(huán)杓后肌肌纖維的橫截面積、直徑和計(jì)數(shù)

2.2青年兔和老年兔甲杓肌和環(huán)杓后肌肌纖維的超微結(jié)構(gòu)比較 透射電鏡下觀察，青年兔甲杓肌肌原纖維排列規(guī)則(圖3a)，肌漿網(wǎng)廣泛擴(kuò)張，未見肌絲溶解，僅見少許輕微的肌絲斷裂和和溶解(圖3b)，個(gè)別細(xì)胞肌絲排列不整齊，線粒體無腫脹(圖3c)；Z線整齊，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體和肌絲正常(圖3d)，肌膜下的線粒體未見明顯異常；環(huán)杓后肌肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，肌絲正常(圖4a)，未見肌絲溶解，可見散在的自噬小體(圖4b)，個(gè)別肌細(xì)胞內(nèi)的線粒體腫脹明顯，線粒體嵴斷裂(圖4c)，肌細(xì)胞間的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞正常。老年兔甲杓肌肌纖維排列正常，Z線排列整齊(圖5a)，肌細(xì)胞核正常，廣泛灶性肌絲斷裂溶解，線粒體腫脹，線粒體內(nèi)嵴及肌漿網(wǎng)擴(kuò)張(圖5b)，可見少量脂滴(圖5c)， 但未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。老年兔環(huán)杓后肌變化較甲杓肌輕，僅見局部小灶性肌絲斷裂溶解(圖6a)，及小灶性的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，線粒體正常(圖6b)，肌漿網(wǎng)有不同程度的擴(kuò)張(圖6c)。

圖1 青年兔甲杓肌(a)和環(huán)杓后肌(b)(HE×40) 圖4 青年兔環(huán)杓后肌透射電鏡圖圖2 老年兔甲杓肌(a)和環(huán)杓后肌(b)(HE×40) 圖5 老年兔甲杓肌透射電鏡圖圖3 青年兔甲杓肌透射電鏡圖圖6 老年兔環(huán)杓后肌透射電鏡圖

3 討論

喉部肌肉包括喉內(nèi)肌和喉外肌，喉外肌起支撐固定喉部和升降喉的作用，具有不易老化的特點(diǎn)；而喉內(nèi)肌控制聲門和喉入口的開閉以及聲帶的張力，由于功能精細(xì)，使用頻繁，其更容易受到老化的不利影響[9]。喉內(nèi)肌包括甲杓肌、環(huán)甲肌、環(huán)杓側(cè)肌、環(huán)杓后肌和杓肌；根據(jù)其功能特征，可分為內(nèi)收肌、外展肌、緊張聲帶肌和降低會(huì)厭肌四組。內(nèi)收肌包括環(huán)杓側(cè)肌和杓肌，其收縮導(dǎo)致聲帶內(nèi)收和聲門閉合。環(huán)杓后肌收縮時(shí)導(dǎo)致聲帶外展和聲門開放，是唯一的外展肌。甲杓肌分為內(nèi)外兩部分，內(nèi)側(cè)部分稱為甲杓內(nèi)肌即聲帶肌，外側(cè)部分稱為甲杓外肌，緊張聲帶肌包括聲帶肌、甲杓外肌和環(huán)甲肌，可見，甲杓肌是主要的聲帶緊張肌。Nishida等[10]研究證實(shí)，24月齡大鼠甲杓肌肌纖維的數(shù)目減少，但肌纖維直徑無變化；而環(huán)杓后肌肌纖維的數(shù)量和直徑都沒有明顯變化。

從本研究結(jié)果看，HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察，老年兔甲杓肌肌纖維間結(jié)締組織較青年兔明顯增多，肌纖維橫截面積和肌纖維計(jì)數(shù)較青年兔顯著減少(P<0.05)，而兩組間環(huán)杓后肌的肌纖維形態(tài)及計(jì)數(shù)均無太大差異，說明老年兔喉部的甲杓肌發(fā)生了明顯的萎縮，而環(huán)杓后肌則萎縮不明顯；透射電鏡觀察顯示，與青年兔比較，老年兔甲杓肌發(fā)生了廣泛灶性肌絲斷裂溶解，線粒體腫脹，線粒體內(nèi)嵴擴(kuò)張；而環(huán)杓后肌的變化較甲杓肌輕，僅見局部小灶性肌絲斷裂溶解，及小灶性的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，線粒體尚可。本研究結(jié)果說明喉內(nèi)肌的老化改變主要發(fā)生在甲杓肌，而環(huán)杓后肌的老化改變較甲杓肌輕。

Conner等[11]研究證實(shí)，在老化的甲杓肌內(nèi)，神經(jīng)肌肉接頭結(jié)構(gòu)的改變與失神經(jīng)支配類似；McMullen等[12,13]研究發(fā)現(xiàn)，與6月齡鼠比較，30月齡鼠的甲杓肌易產(chǎn)生顫搐和強(qiáng)直性張力低，最大收縮速度減少20%，去負(fù)載收縮速度減少27%，糖元含量增加，抗疲勞性下降，說明隨著年齡增加，鼠甲杓肌收縮變?nèi)踝兟?，且易疲勞。上述關(guān)于喉部肌肉與年齡相關(guān)性變化的研究及本研究都證實(shí)，隨著年齡增長(zhǎng)，喉內(nèi)肌發(fā)生了不同程度的老化改變，而且控制聲帶張力主要影響發(fā)聲功能的甲杓肌退行性變較控制聲門開放主要影響呼吸運(yùn)動(dòng)的環(huán)杓后肌更明顯。有研究證實(shí)，老化常引起甲杓肌的萎縮性變化從而改變聲帶邊緣的直線狀態(tài)[2]，喉鏡檢查的典型表現(xiàn)為弓形聲帶發(fā)聲時(shí)聲門呈梭形裂隙[14]，提示老年嗓音的發(fā)生主要與甲杓肌而不是環(huán)杓后肌的老化改變有關(guān)。

關(guān)于衰老對(duì)喉組織的影響和年齡相關(guān)性的嗓音變化，還有很多需要探索的問題。目前大多研究采用動(dòng)物模型，而人喉無論是在肌纖維成分、形態(tài)結(jié)構(gòu)，還是在利用聲帶的模式上，均與動(dòng)物存在明顯不同。本研究結(jié)果雖提示老年嗓音主要與甲杓肌的老化有關(guān)，但還需要進(jìn)一步證實(shí)，并更深入探討喉內(nèi)肌老化導(dǎo)致嗓音年齡相關(guān)性改變的具體機(jī)制。