三葉木通離體培養(yǎng)和多倍體誘導(dǎo)

姜放軍，陶抵輝

（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410127）

三葉木通（Akebia trifoliate）為落葉木質(zhì)藤本，在湖南省主要分布于湘西武陵山和雪峰山地區(qū)及湘東羅霄山脈地區(qū)，湘中、湘南、湘北也有少數(shù)分布[1]。三葉木通具有美容養(yǎng)顏、保健、清理體內(nèi)垃圾、提高免疫力等奇特功效[2]，是一種潛力很大的保健水果。三葉木通果實目前以野生果為主，因其國內(nèi)外市場蘊(yùn)含著巨大潛力，野生果的產(chǎn)量在當(dāng)?shù)匾压┎粦?yīng)求。在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和構(gòu)建和諧社會的省情下，結(jié)合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，三葉木通作為一項高效農(nóng)業(yè)種植項目將受到社會關(guān)注。

三葉木通長期野生尚未開發(fā)的主要原因是籽多、皮厚、鮮食率低。已有研究資料表明，野生三葉木通為二倍體，染色體數(shù)是16[3]。三倍體無籽西瓜的成功研究[4]和生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用具有示范作用。野生三葉木通若用人工加倍的方法育成三倍體植株，籽多、皮厚、鮮食率低的缺陷能有很大程度上的改進(jìn)，從而提高商品質(zhì)量。該試驗旨在以三葉木通帶芽莖段為外植體，構(gòu)建三葉木通離體快繁體系，再用秋水仙素溶液對增殖芽誘導(dǎo)，獲得多倍體材料，為三葉木通的種質(zhì)創(chuàng)新及三倍體三葉木通品種的選育奠定基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料三葉木通采自湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院藤本植物資源圃。選取當(dāng)年生健壯無病蟲害、半木質(zhì)化的三葉木通莖段，現(xiàn)采現(xiàn)用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理與消毒。將采集的莖段去除葉片后，先用適量的洗潔精水浸泡5 min，再用自來水流水沖洗20 min。材料瀝干自來水后置于超凈工作臺中，然后用75%酒精消毒 30 s，無菌水沖洗 1 次，0.1% HgCl2消毒 10 min，無菌水沖洗5 次，瀝干水備用。將消毒好的莖段分割成1.0～1.5 cm長的單芽莖段接種到培養(yǎng)基（添加蔗糖30 g/L、瓊脂7.5 g/L，pH 5.8～6.0，下同）中。

1.2.2 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。選用WPM 和MS 基本培養(yǎng)基，并分別添加 2.0 mg/L 6-BA，0.2 mg/L NAA，2.0 mg/L GA3。每個培養(yǎng)瓶接種3 個外植體，培養(yǎng)基配方每個組合接種10個培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)情況，篩選出適宜的培養(yǎng)基。

最適基本培養(yǎng)基確定好后，將消毒的單芽莖段接種在含 6-BA（0、1.0、2.0 mg/L）、NAA（0、0.1、0.5 mg/L）和 GA3（0、1.0、2.0 mg/L）的 WPM 培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)，1 000 lx光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率，每個處理接種30 個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶接種3 個外植體。腋芽誘導(dǎo)率＝（萌芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)。將初代培養(yǎng)的腋芽切下后轉(zhuǎn)接到含 6-BA（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）、NAA（0、0.2 mg/L）的 WPM培養(yǎng)基中，每個處理接種30 個培養(yǎng)瓶，每瓶接種2 個不定芽，溫度（25±2）℃，1 000 lx 光照條件下培養(yǎng)，40 d 后統(tǒng)計增殖系數(shù)。増殖系數(shù)＝增殖后獲得的芽數(shù)／接種時的芽數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)。待叢生芽長到2～3 cm 時，切取生長健壯的芽苗接種在 1/2 MS 含 NAA（0、1.0、2.0 mg/L）、GA3（0、1.0 mg/L）的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每個處理接種30個培養(yǎng)瓶，每瓶接種2 個芽，25 d 后統(tǒng)計生根率。生根率＝（生根的芽總數(shù)/接種芽總數(shù)）×100%。

1.2.5 多倍體誘導(dǎo)及鑒定。將生長良好的幼嫩叢生芽接入抽濾滅菌的秋水仙素溶液（0.1%、0.3%、0.5%）中，搖床振蕩培養(yǎng)（12、24、48 h），搖床轉(zhuǎn)速為 50 r/min，培養(yǎng)溫度為25℃，光照（1 000 lx）24 h/d，處理后用無菌水清洗藥液，然后接種到最佳增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

鑒定方法采用染色體計數(shù)方法，取叢生芽→預(yù)處理（對二氯苯+α-溴萘飽和溶液）5～6 h→固定（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）2 h 以上→70%酒精保存→去離子水清洗→解離（1 mol/L 鹽酸，在60℃下）12 min→去離子水清洗→染色（卡寶品紅常規(guī)）3～5 min →壓片（十字壓片法）→鏡檢、鑒定。根據(jù)染色體數(shù)確定加倍處理材料的倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對三葉木通腋芽誘導(dǎo)率的影響

用WPM 和MS 2 種培養(yǎng)基進(jìn)行三葉木通腋芽誘導(dǎo)，由表1 可知，WPM 培養(yǎng)基的腋芽誘導(dǎo)率明顯高于MS 培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率，下面的腋芽誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)均選用WPS 培養(yǎng)基。

表1 基本培養(yǎng)基對三葉木通腋芽誘導(dǎo)率的影響

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對三葉木通腋芽誘導(dǎo)的影響

由表2 可知，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑組（A1）不能使三葉木通腋芽萌發(fā)，當(dāng)6-BA 濃度為0 mg/L 時，添加NAA 和GA3少數(shù)三葉木通莖段萌發(fā)腋芽，且有部分莖段基部愈傷化；當(dāng)6-BA 濃度為1.0 mg/L，NAA 濃度為0.1 mg/L，GA3濃度為2.0 mg/L 時，三葉木通腋芽長勢較好，誘導(dǎo)率達(dá)75.12%。隨著6-BA 濃度升高，三葉木通腋芽誘導(dǎo)率呈下降趨勢，添加NAA 濃度為0.5 mg/L 的處理組均有部分愈傷化，可能是NAA 濃度添加過高而導(dǎo)致，從而抑制腋芽的萌發(fā)。在7 個三葉木通腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理組中，最適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L GA3。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對三葉木通腋芽誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對三葉木通不定芽增殖系數(shù)的影響

三葉木通繼代增殖培養(yǎng)過程中添加了不同濃度的6-BA 和NAA，共設(shè)置了8 個培養(yǎng)基處理組。由表3 可知，在不添加6-BA 的處理組中，三葉木通不定芽沒有呈現(xiàn)增殖生長現(xiàn)象；在添加6-BA 的處理組中，隨著6-BA 的濃度升高，增殖系數(shù)呈上升趨勢，當(dāng)6-BA 濃度為3.0 mg/L 時增殖系數(shù)最高，說明細(xì)胞分裂素6-BA 在三葉木通不定芽增殖中起主導(dǎo)作用，同時低濃度NAA 起到輔助作用。在8個三葉木通繼代增殖培養(yǎng)基處理組中，最適宜的繼代培養(yǎng)基為WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對三葉木通不定芽增殖系數(shù)的影響

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對三葉木通不定芽生根率的影響

三葉木通生根培養(yǎng)25 d 后不定芽有根系生長，在不同的處理組中，不定芽生根情況有差異。由表4 可知，不添加NAA 處理組不能使三葉木通生根；添加NAA 的處理組均有根系生長，當(dāng)NAA 濃度為1.0 mg/L、GA3濃度為 1.0 mg/L 時，根系生長較好，生根率高，而NAA 濃度為0.2 mg/L 處理組有根系生長，但出現(xiàn)部分愈傷化。結(jié)果表明細(xì)胞生長素NAA 在三葉木通生根誘導(dǎo)中起主導(dǎo)作用，同時GA3起到促進(jìn)作用，但高濃度的NAA 會促使芽愈傷化，降低生根率。最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3。

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對三葉木通不定芽生根率的影響

2.5 秋水仙堿對三葉木通不定芽多倍體誘導(dǎo)的影響

采取秋水仙堿溶液直接浸泡方式對三葉木通多倍體誘導(dǎo)，并通過染色體直接計數(shù)。由表5 可知，三葉木通叢生芽用3 種不同濃度的秋水仙堿溶液浸泡12 h，均沒有獲得加倍體，浸泡延長至24 h 時，0.3%、0.5%秋水仙堿溶液均能誘導(dǎo)加倍體，但0.3%秋水仙堿溶液誘導(dǎo)效果好，誘導(dǎo)率為15%，浸泡再次延長至48 h 時，只有0.3%秋水仙堿溶液能誘導(dǎo)多倍體，且誘導(dǎo)效果較浸泡24 h 處理組的誘導(dǎo)效果差。不同濃度秋水仙堿在同一處理時間誘導(dǎo)率并沒有隨著濃度的變化而呈現(xiàn)誘導(dǎo)率上升的趨勢，其原因可能是高濃度的秋水仙素對叢生芽的傷害大，使得存活下來的叢生芽數(shù)減少，并且生活力下降，從而使檢測到加倍的叢生芽塊數(shù)相應(yīng)很少。

表5 秋水仙堿對三葉木通不定芽多倍體誘導(dǎo)的影響

3 討論

三葉木通在WPM 培養(yǎng)基比MS 培養(yǎng)基中腋芽誘導(dǎo)率高，這與吳玲利等在白木通莖段腋芽誘導(dǎo)[5]中的研究結(jié)果相一致。腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用6-BA、NAA 和GA3激素組合，在同一濃度的條件下加入GA3和不加入GA3誘導(dǎo)效果不一樣，表明GA3在初代腋芽生長中起到促進(jìn)作用，這與岑忠用等在木薯腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)的研究[6]結(jié)果相一致，同時，在三葉木通初代培養(yǎng)時，NAA 濃度為0.5 mg/L 時有莖段基部出現(xiàn)愈傷化，可用IBA 代替NAA 做進(jìn)一步研究。

繼代增殖培養(yǎng)是組培離體快繁的關(guān)鍵，找到適宜的增殖培養(yǎng)基配方，才能達(dá)到組培快速繁殖的目的。在繼代增殖培養(yǎng)過程中，6-BA 和NAA 是常用的激素組合[7]。在三葉木通腋芽增殖培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用NAA 不能使腋芽增殖；單獨(dú)使用6-BA 腋芽能增殖，但生長較弱，說明6-BA 在增殖培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用；一定濃度6-BA 和NAA組合使用增殖效果好，且隨著6-BA 的濃度增高增殖系數(shù)升高，這與姜傲芳等在薜荔中的研究[8]結(jié)果相一致。三葉木通生根培養(yǎng)選用1/2 MS 培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)試管苗的生根效果更好，說明降低無機(jī)鹽的濃度更有利于根的誘導(dǎo)，這與羅士偉等在無籽西瓜生根試驗[9]中的結(jié)果相一致。

三葉木通染色體加倍是種質(zhì)創(chuàng)新的主要途徑之一，陶抵輝等指出染色體加倍方法有形態(tài)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、染色體記數(shù)、分子水平的鑒定等[10]，熊大勝等用秋水仙素浸泡三葉木通根發(fā)現(xiàn)混倍性明顯，四倍性細(xì)胞只占31.7%～37.9%[11]。該試驗發(fā)現(xiàn)用0.3%秋水仙堿浸泡無菌試管苗24 h 能獲得四倍體叢生芽塊，雖然叢生芽誘導(dǎo)率低，但憑借其快速增殖的優(yōu)勢，能獲得大量加倍叢生芽。對于同一材料，染色體加倍概率通常隨處理強(qiáng)度的增大而增大，但同時秋水仙素對細(xì)胞傷害增大，死亡率提高，因此，選擇合適的濃度和處理時間至關(guān)重要。該研究以三葉木通帶芽莖段為外植體，構(gòu)建三葉木通離體快繁體系，進(jìn)行三葉木通多倍體誘導(dǎo)和鑒定，為三葉木通的種質(zhì)創(chuàng)新和三葉木通品種的選育奠定了基礎(chǔ)和技術(shù)支持。