酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合物促進早期牙酸蝕癥再礦化的體外研究

王偉萍，何慶銀，張恒俊

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·佛山市口腔醫(yī)院，廣東佛山528000）

牙酸蝕癥是在沒有細(xì)菌參與的情況下，由接觸牙面的酸或其螯合物的化學(xué)侵蝕作用而引起的一種慢性病理性的牙體硬組織喪失［1］。自20世紀(jì)80年代以來，伴隨著我國人民生活水平的提高及酸性飲料的消費量增加，牙酸蝕癥的患病率明顯上升。酸性飲料引起的牙酸蝕癥已引起人們的關(guān)注，正成為一個新的影響青少年口腔健康的問題［2-3］。對早期牙酸蝕癥進行再礦化治療，能防止其病損進一步發(fā)展，促進脫礦釉質(zhì)恢復(fù)到正常狀態(tài)。

本研究通過體外模擬牙酸蝕癥，研究酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合物（CPP-ACP）對早期牙酸蝕癥的再礦化作用，為臨床更好地治療牙酸蝕癥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 牙體標(biāo)本的制備

選取本院因正畸減數(shù)所拔除的新鮮前磨牙，體視顯微鏡放大10倍下檢查，無齲壞、裂痕、缺損和釉質(zhì)白斑者納入實驗。流水下截冠去髓后，用自凝型義齒基托樹脂包埋釉質(zhì)塊基底，測試面釉質(zhì)嚴(yán)格磨平拋光，暴露正中3 mm×3 mm開窗區(qū)，其余區(qū)域用指甲油封閉。

1.2 體外模擬酸蝕癥

將60個制備好的標(biāo)本浸泡在可口可樂中。飲料浸泡是間斷性的，每次浸泡1 min，取出30 s，再浸入，反復(fù)多次，歷時10 min，然后用蒸餾水清洗5遍，置于37℃人工唾液恒溫箱。每天重復(fù)上述的操作10次，12 h內(nèi)完成。共處理7天。

1.3 CPP-ACP的配制

稱取1 g CPP溶解于50 mL濃度為72 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH值7.0），置于電磁力攪拌器上攪拌，逐滴加入1.0 mol/L的CaCl2溶液，用KOH維持pH值不變，再加入6 mL CaCl2后，用去離子水調(diào)整溶液的體積至100 mL，最后配制成pH值為7.0的1%CPP-ACP溶液（含1.0%W/V的CPP，60 mmol/L CaCl2，36 mmol/L 磷酸鈉）［4］。

1.4 分組和再礦化實驗

根據(jù)體外酸蝕后的牙釉質(zhì)表面硬度將60個樣本隨機分成4組，每組15個，分別浸泡在4種再礦化液中：0.2%NaF溶液（A組）、1%CPP-ACP溶液（B組）、0.2%NaF+1%CPP-ACP溶液（C組）和去離子水（D組）。置于37℃恒溫箱內(nèi)，浸泡液每天更換一次，7 d后結(jié)束實驗。

1.5 牙釉質(zhì)表面硬度測量

各組樣本分別在基線、可樂酸蝕后和再礦化后用維氏顯微硬度計測定釉質(zhì)表面硬度（SMH）。采用DHV-1000型顯微硬度計，物鏡放大40倍，將標(biāo)本固定在載物臺上，使用維式壓頭，負(fù)荷100 g，時間15 s，使其形成壓痕，顯微鏡下測量菱形壓痕的兩條對角線長度，經(jīng)分析系統(tǒng)自動計算出硬度值。每一個開窗面測定5個點，去掉最大值和最小值后取平均值作為該開窗釉質(zhì)表面的硬度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

人工牙酸蝕后，所有開窗區(qū)的牙釉質(zhì)表面完好，無缺損，無光澤，呈白堊色，吹干后白堊色更明顯。經(jīng)4種再礦化液處理后，開窗區(qū)牙釉質(zhì)仍呈白堊色，除去離子水組外，其余3組白堊色較再礦化前淺。

2.2 釉質(zhì)表面顯微硬度測量

在實驗前和體外牙酸蝕后，各組之間的釉質(zhì)表面顯微硬度相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），具有可比性。經(jīng)過4種不同溶液處理后，其他3組的釉質(zhì)表面顯微硬度較去離子水組均顯著增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），且C組增加最多，除了A、B組的釉質(zhì)表面顯微硬度無明顯差異（F=2.961，p=0.096）外，其余兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.001）。結(jié)果如表1所示。

表1 各組標(biāo)本開窗區(qū)表面硬度值HV（±s，n=15） （Pa）

表1 各組標(biāo)本開窗區(qū)表面硬度值HV（±s，n=15） （Pa）

組別A 組（0.2%NaF）B組（1%CPP-ACP）C 組（0.2%NaF+1%CPP-ACP）D組（去離子水）F值p值基線302.03±8.61 301.85±9.91 304.05±7.68 304.55±7.64 0.392 0.759體外牙酸蝕后61.14±3.25 61.23±3.50 60.95±2.76 61.18±3.57 0.02 0.996再礦化后114.97±6.79 118.99±5.98 176.28±6.61 61.37±5.62 841.92＜0.001

3 討論

牙酸蝕癥于1907年首次被報道，患病率從20%～71%不等，且呈上升趨勢，近年來明顯增高［5］。牙酸蝕癥的致病因素是復(fù)雜的，酸性飲料起重要作用［6］。有學(xué)者對牙酸蝕癥進行臨床調(diào)查，發(fā)現(xiàn)攝入酸性飲料多的人群患有牙酸蝕癥明顯高于酸性飲料攝入量少的人群［7］，多個體外研究也表明酸性飲料可以導(dǎo)致牙釉質(zhì)及牙本質(zhì)脫礦，繼而造成牙酸蝕癥［8-9］。牙酸蝕癥早期牙釉質(zhì)光滑面輕微脫礦出現(xiàn)白堊色，但通過肉眼很難準(zhǔn)確判斷。釉質(zhì)表面硬度是牙釉質(zhì)重要的物理性能之一，F(xiàn)eatherstone等［10］證實釉質(zhì)顯微硬度值的大小與其礦物含量具有直線相關(guān)性。故本實驗選擇市面上常見的可樂碳酸飲料給予長時間、多頻次的持續(xù)干預(yù)，模擬正常口腔內(nèi)飲用酸性飲料的狀態(tài)，制備出牙酸蝕癥模型，然后通過測量其釉質(zhì)表面顯微硬度的變化來反應(yīng)釉質(zhì)礦物質(zhì)的喪失和獲得。7 d后所有樣本的釉質(zhì)表面硬度較酸蝕前明顯降低（p＜0.05），差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。這與劉志萍［11］等人研究飲料對牙釉質(zhì)硬度影響得出的結(jié)果一致。由此可見，可樂碳酸飲料可以促使牙釉質(zhì)酸蝕脫礦。

早期牙酸蝕癥主要表現(xiàn)為釉質(zhì)脫礦。如果能對脫礦的牙釉質(zhì)進行再礦化治療，使流失的鈣、磷等無機離子重新在已脫礦的牙釉質(zhì)表面沉積并結(jié)晶化，就可以阻斷牙酸蝕癥的進一步發(fā)展。氟化物是最經(jīng)典的再礦化材料。當(dāng)牙受酸侵蝕時，口腔環(huán)境中pH值下降，釉質(zhì)的羥磷灰石（HA）溶解，氟可與釉質(zhì)中羥基離子交換形成氟磷灰石（FA）重新沉積于脫礦的釉質(zhì)表面，或吸附于HA上直接進入晶體形成氟羥磷灰石（FHA），促進再礦化。有學(xué)者研究指出，低濃度氟化物的再礦化效果并不明顯，當(dāng)氟的濃度增加到1 000～1 500 mg/L以上時，其作用會發(fā)揮得更好［12］。但是高濃度氟化物的使用存在很大的安全問題，長期應(yīng)用可能會導(dǎo)致慢性氟中毒如氟牙癥和氟骨癥，還會誘使耐氟菌株的產(chǎn)生［13］等。因此探索新的安全有效的再礦化材料勢在必行。酪蛋白磷酸肽（CPP）是從牛奶中酶解消化后分離純化而提取的生物活性多肽，具有食用安全、致敏性小、無細(xì)胞毒性的優(yōu)點［14］。CPP有很強的促鈣吸收活性，可與非結(jié)晶型磷酸鈣（ACP）結(jié)合形成納米晶簇酪蛋白磷酸肽鈣磷復(fù)合物（CPP-ACP）。CPP-ACP在牙釉質(zhì)表面始終保持一種過飽和的狀態(tài)，為牙齒提供具有生物活性的鈣、磷離子的儲庫，起到抑制牙釉質(zhì)脫礦并促進再礦化的作用［15］。

本實驗以0.2%NaF為陽性對照組，以去離子水為陰性對照組，采用測量釉質(zhì)表面顯微硬度來研究CPP-ACP對酸蝕釉質(zhì)的作用。結(jié)果顯示：1%CPP-ACP和0.2%NaF均能使可樂酸蝕后的牙釉質(zhì)表面顯微硬度顯著增加，兩組的釉質(zhì)表面顯微硬度比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），這表明1%CPP-ACP有促進酸蝕脫礦的牙釉質(zhì)再礦化作用，該作用與0.2%NaF相當(dāng)，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果［16-17］相似。使用1%CPP-ACP+0.2%NaF的混合液再礦化后與單獨使用CPP-ACP或NaF相比，前者的釉質(zhì)表面顯微硬度明顯高于后者，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），提示氟的加入增強了CPP-ACP的再礦化能力。這種協(xié)同作用可能與CPP穩(wěn)定鈣磷離子的同時可以結(jié)合氟離子，形成一種新型的非結(jié)晶型磷酸氟鈣相（ACFP）有關(guān)［18］。ACFP中的氟離子活性增強，更具有滲透力，能夠進入齲損深層，促進再礦化時晶體的生長，加上CPP結(jié)合的ACP在牙釉質(zhì)表面始終保持鈣磷飽和的狀態(tài)，因此ACFP對脫礦牙釉質(zhì)的再礦化作用相當(dāng)明顯。國內(nèi)外多位學(xué)者的研究證實該觀點［19-20］。

綜上所述，CPP-ACP是一種天然的再礦化制劑，相比于氟化物，無毒副作用，安全性能高，可與氟協(xié)同再礦化作用，這為早期牙酸蝕癥的防治提供一種新思路，但其確切作用機制及有效實際應(yīng)用仍待進一步研究。