利用制備液相色譜系統(tǒng)分離中藥槐花米中的蘆丁

彭毓敏 ，朱 峰 ，周 炎 ，古世陽(yáng)

（1.廣東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥物調(diào)配中心，廣東佛山528200；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東佛山528000；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院佛山市活性天然產(chǎn)物與功能化學(xué)品工程技術(shù)研究中心，廣東佛山528000）

蘆丁具有多種生物活性［1-3］，比如抗氧化、降血壓、抗癌等，受到人們的廣泛重視。為了揭示其作用機(jī)理，近年來(lái)研究者們運(yùn)用新技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，特別是Samsonowicz等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蘆丁與堿金屬離子結(jié)合后，其抗氧化能力和抗微生物活性均顯著增強(qiáng)［3-4］。蘆丁存在于羅布麻［5］和文冠果葉［6］中，在槐花米中的含量較高，槐花米是制取蘆丁的重要中藥資源?，F(xiàn)有不同的方法均是利用高效液相色譜技術(shù)測(cè)定槐花米中蘆丁的含量［7-10］，未見利用制備液相色譜技術(shù)從槐花米中制取高純度蘆丁的方法。本研究開發(fā)一種利用制備液相色譜系統(tǒng)從槐花米中分離制備蘆丁的快速方法，并利用NMR技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，為槐花米中高純度蘆丁的制備提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

（1）儀器。Prep 150 LC制備液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters），RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA），ETF-60無(wú)液氦核磁共振波譜儀（美國(guó)Anasazi）。

（2）試劑?；被祝ㄊ惺郏?，甲醇（分析純），乙酸（分析純），超純水。

1.2 槐花米中蘆丁的提取

采用甲醇連續(xù)滲漉回流提取槐花米中的蘆丁。稱取10 g槐花米粉末裝入125 mL筒形恒壓漏斗，壓實(shí)后蓋上一層脫脂棉，安裝到已放入沸石的250 mL圓底燒瓶上。從恒壓漏斗上口加入150 mL甲醇經(jīng)槐花米粉末滲漉到圓底燒瓶中，保持甲醇液面高于槐花米粉末，關(guān)上恒壓漏斗旋塞。安裝好球形冷凝管，接通冷卻水，用90℃恒溫水浴加熱回流。待有回流液滴入恒壓漏斗時(shí)，旋開漏斗旋塞，保持滲漉液滴入燒瓶中的液滴速度和回流速度一致。連續(xù)滲漉回流提取60 min。甲醇提取液在50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收甲醇得浸膏，然后用150 mL沸水溶解浸膏，趁熱過(guò)濾至250 mL燒杯中，待冷卻至室溫后置于4℃冰箱中冷卻60 min，析出大量黃色沉淀，抽濾，沉淀用冰水洗滌后，置于105℃烘箱中烘干，得到粗蘆丁2.11 g，提取率21.1%。

1.3 粗蘆丁的分離純化

1.3.1 樣品溶液的準(zhǔn)備

稱取0.5 g粗蘆丁用75 mL體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇水溶液加熱溶解，用普通濾紙過(guò)濾，濾液冷卻后再過(guò)0.45 μm濾膜，得到粗蘆丁樣品溶液。

1.3.2 制備液相色譜條件

（1）制備液相色譜系統(tǒng)。配有2545二元梯度模塊的Prep 150 LC系統(tǒng)、5 mL定量環(huán)的Waters自動(dòng)進(jìn)樣器、2489紫外可見光檢測(cè)器、Waters餾分收集器III及ChromScope軟件。

1.3.3 蘆丁的結(jié)構(gòu)鑒定

將分離純化得到的蘆丁餾分通過(guò)50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積一半，析出大量沉淀，進(jìn)一步置于4℃冰箱冷卻30 min，抽濾，沉淀用冰水洗滌后置于90℃烘箱中烘干，得到淡黃色蘆丁產(chǎn)品。取約20 mg蘆丁產(chǎn)品用氘代二甲基亞砜（DMSO-d6）溶解后，進(jìn)行核磁共振波譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 槐花米中蘆丁的提取

大多數(shù)文獻(xiàn)均采用堿溶酸沉法從槐花米中提取蘆?。?1］。筆者在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)堿溶酸沉法提取，要用到多種試劑，比如熟石灰、硼砂和鹽酸，且操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。特別是如果酸化步驟沒能控制好pH值，容易導(dǎo)致析不出蘆丁沉淀或析出不完全。本文根據(jù)蘆丁在甲醇中的溶解性較好的特點(diǎn)，采用甲醇連續(xù)回流滲漉提取，既減少了試劑品種和操作步驟，又提高了蘆丁提取率，粗蘆丁提取率達(dá)21.1%。另外，甲醇回收后還可以重復(fù)利用，既節(jié)省了提取成本，又避免了環(huán)境污染。

2.2 粗蘆丁的分離純化

蘆丁是黃酮苷類化合物，含有多個(gè)酚羥基，有一定酸性，在液相色譜分離中易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，使用酸性水溶液為流動(dòng)相可以有效避免這一現(xiàn)象。本文選擇0.2%乙酸水溶液為流動(dòng)相A。根據(jù)蘆丁和槐花米中其他成分（槲皮素、染料木素等）的紫外吸收特點(diǎn)，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)方法，設(shè)置紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。由于Prep 150 LC系統(tǒng)的耐壓局限性，流速太高，會(huì)超出系統(tǒng)耐壓范圍；流速太低，又會(huì)導(dǎo)致分離時(shí)間較長(zhǎng)，設(shè)置流速為10 mL/min。在本文樣品濃度下，進(jìn)樣量太高（5 mL），會(huì)導(dǎo)致蘆丁分離峰出現(xiàn)平頭現(xiàn)象；進(jìn)樣量少，雖然可以避免這一現(xiàn)象，但需要分離的實(shí)驗(yàn)次數(shù)增多，既耗時(shí)又耗流動(dòng)相。試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣量為2.5 mL是合適的。在流動(dòng)相組成條件摸索中發(fā)現(xiàn)，甲醇含量低，蘆丁保留時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，如果甲醇含量高，則部分雜質(zhì)會(huì)和蘆丁分離峰部分重疊，達(dá)不到好的分離效果。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)摸索后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相組成為45%A和55%B時(shí)，可以有效實(shí)現(xiàn)蘆丁的分離純化，如圖1所示。

圖1 槐花米中粗蘆丁的液相色譜

分析圖1可知，粗蘆丁樣品含有3個(gè)主要成分。根據(jù)文獻(xiàn)［7，9］推測(cè)，含量最大的峰1（保留時(shí)間7.94 min）可能是蘆丁，而含量較低的峰2（保留時(shí)間10.80 min）和峰3（保留時(shí)間18.99 min）可能為槲皮素和染料木素。由于峰3保留時(shí)間較長(zhǎng)，為18.99 min，如果等到峰3完全跑完，耗時(shí)較長(zhǎng)，也比較耗流動(dòng)相。繼續(xù)分析發(fā)現(xiàn)，如果不等到第1針樣品的峰3跑完，在第1針樣品運(yùn)行至15 min時(shí)就進(jìn)入第2針樣品，那么在相同洗脫條件下，第1針樣品未跑完的峰3則會(huì)出現(xiàn)在第2針樣品的峰1前面。實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一設(shè)想，如圖2所示。因此，設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣程序在前一針進(jìn)樣后15 min自動(dòng)進(jìn)入第2針樣品。這樣既可以節(jié)省分離純化時(shí)間，又可以節(jié)省流動(dòng)相用量。

進(jìn)一步分析圖1和2可以發(fā)現(xiàn)，粗蘆丁樣品中峰2和峰3的豐度均低于250 mAU，而峰1的豐度則遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于250 mAU。因此設(shè)置餾分自動(dòng)收集方法按豐度收集，當(dāng)在運(yùn)行7～9 min內(nèi)收集豐度大于250 mAU的餾分，這樣可以收集得到純凈的峰1組分。在相同色譜條件下用同一Prep 150 LC系統(tǒng)分析收集得到的餾分，進(jìn)樣量為0.5 mL，得到液相色譜如圖3所示。圖3顯示只有1個(gè)蘆丁色譜峰而沒有雜質(zhì)峰，表明已實(shí)現(xiàn)高純度蘆丁的分離制備。

圖2 槐花米中粗蘆丁的制備液相色譜

圖3 槐花米中純蘆丁的液相色譜

2.3 蘆丁的結(jié)構(gòu)鑒定

從峰1餾分得到的產(chǎn)品，其1H NMR譜如圖4所示。

圖4 蘆丁的1H NMR譜（60 MHz，溶劑DMSO-d6）

由圖4可知，在δ12.61（s，1H）、10.81（br s，1H）、9.66（br s，1H）和9.17（br s，1H）顯示4個(gè)酚羥基質(zhì)子信號(hào)，在δ7.59（m，2H）、6.86（d，1H）、6.40（s，1H）和6.21（s，1H）給出5個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，在δ5.5～3.0給出多個(gè)連氧飽和碳?xì)湫盘?hào)，δ3.21的質(zhì)子信號(hào)與δ3.39的水峰信號(hào)重疊在一起，還顯示1個(gè)甲基信號(hào)在δ1.01（d,3H），而δ2.50的信號(hào)是DMSO-d6的溶劑峰信號(hào)。

另外，13CNMR譜如圖5所示。

圖5 蘆丁的13C NMR 譜（15.125 MHz，DMSO-d6）

圖5給出27個(gè)碳信號(hào)，其中1個(gè)羰基碳信號(hào)在δ176.90，14個(gè)芳香碳和2個(gè)縮醛碳信號(hào)則分別在δ163.50、160.67、156.26、155.99、147.83、144.26、132.76、120.83、120.55、115.74、114.71、103.40、100.68、100.27、98.13和93.20，9 個(gè)連氧飽和碳信號(hào)則在δ75.88、75.32、73.60、71.39、71.23、69.95、69.59、67.62和66.31，1個(gè)甲基碳信號(hào)在δ17.14。1H NMR譜和13C NMR譜信號(hào)特征均符合蘆丁化學(xué)結(jié)構(gòu)式的特點(diǎn)，如圖6所示，并與文獻(xiàn)［5，6，12］中蘆丁的數(shù)據(jù)基本一致。故可確認(rèn)通過(guò)制備液相色譜從槐花米中分離得到的峰1餾分是目標(biāo)產(chǎn)物蘆丁。

圖6 蘆丁的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

將傳統(tǒng)的堿提酸沉法改用甲醇連續(xù)滲漉回流提取槐花米中的蘆丁，可以減少操作步驟，提高提取效率，避免多種化學(xué)試劑特別是管控試劑鹽酸的使用，且甲醇可以回收重復(fù)使用，降低了提取成本。

將粗蘆丁按比例（0.5 g/75 mL）溶于70%甲醇水溶液后，使用Prep 150 LC制備液相色譜系統(tǒng)，制備分離色譜條件為SunFirePrep C18OBDTM色譜柱（5 μm，19 mm × 250 mm）、柱溫為室溫、流動(dòng)相 A 為0.2%乙酸水溶液、流動(dòng)相B為甲醇、流動(dòng)相組成為45%A與55%B（等度洗脫）、流速為10 mL/min、進(jìn)樣量為2.5 mL、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm、設(shè)置運(yùn)行時(shí)間15 min。采用連續(xù)自動(dòng)進(jìn)樣，自動(dòng)收集豐度大于250 mAU的餾分，可快速高效從粗蘆丁中分離得到高純度的蘆丁產(chǎn)品。該產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)得到NMR波譜確證。

總之，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果為利用Prep 150 LC制備液相色譜系統(tǒng)快速高效地從中藥槐花米中制備分離高純度的蘆丁提供了一種值得推廣的方法。