姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞增殖、侵襲能力及相關(guān)蛋白的影響

劉 晶， 馬建增， 劉淑榮， 鄭海亮

（山東省陽光融和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，濰坊 261000）

子宮內(nèi)膜癌是一種常見的上皮性惡性腫瘤性疾病，是目前女性生殖道三大惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害女性生命健康[1]。姜黃素是一種傳統(tǒng)中藥，其藥理學(xué)作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2]，近年來其抗腫瘤作用日漸受到諸多醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。研究[3-4]報(bào)道，姜黃素可有效抑制肝癌Huh7 細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖，抗腫瘤作用顯著，但目前關(guān)于其抗腫瘤作用機(jī)制尚不明確，因此，本研究通過探究姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞增殖、侵襲能力的抑制作用，并分析其對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，為其臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑

姜黃素（廣州龍德生物科技有限公司，純度99%，生產(chǎn)批號(hào)：SC20141011000026）、胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國 Gibco 公司）、噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（天津科瑞杰生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、Matrigel 膠（美國 BD 公司）、鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9（MMP-2、MMP-9）多克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、鼠抗人細(xì)胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）（美國 Santa Cruz 公司）等。

1.3 主要儀器

HERACELL150i 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Thermo scientific公司）、Transwell 小室（美國Millipore公司）、CKX41 型光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）、SW-CJ-IFD 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、Elx800 酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司）、Quantity One 1-D 分析軟件（美國Bio-Rad 公司）等。

1.4 方法

1.4.1 子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞，并進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期HEC-1-B 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以胰蛋白酶調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，200 μL/孔，設(shè) 8 復(fù)孔對(duì)照，低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組HEC-1-B 細(xì)胞分別以30、60、120 μmol·L-1姜黃素及等量生理鹽水處理，各組分別處理24、36 和48 h。

1.4.2 MTT 法檢測(cè)HEC-1-B 細(xì)胞增殖情況 細(xì)胞分組與處理同1.4.1，各組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔對(duì)照，且實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，具體如下：分別于干預(yù)24、36 和48 h時(shí)，加入 MTT 溶液，每孔 10 mg·mL-1，培養(yǎng) 4 h，棄上清，避光加150 μL/孔二甲基亞砜溶液，輕微震蕩，以全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm 處的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。HEC-1-B 細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（對(duì)照組OD490nm-低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組 OD490nm）/對(duì)照組 OD490nm×100%[5]。

1.4.3 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HEC-1-B 細(xì)胞侵襲能力 以預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋Matrigel（體積比 1 ∶5），將 Matrigel（100 μL）覆 蓋Transwell 小室上室，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3 h。細(xì)胞分組及處理同1.4.1，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，上室加入100 μL 細(xì)胞懸液，下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育 48 h 后取出小室，小心擦拭上室內(nèi)側(cè)面未遷移出的細(xì)胞，以甲醛固定30 min，室溫下加0.1%結(jié)晶紫染色25 min。光學(xué)顯微鏡下于各小室中隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算細(xì)胞侵襲率（%）=下室侵襲細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)量×100%[6]。

1.4.4 WB 法檢測(cè) HEC-1-B 細(xì)胞中 MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白的表達(dá) 細(xì)胞分組及處理同1.4.1，收集干預(yù)48 h 時(shí)的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，參照BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，取適量蛋白經(jīng)10%分離膠及5%濃縮膠行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜；分別加入鼠抗人MMP-2抗體（1∶250）、鼠抗人 MMP-9 抗體（1∶250）、鼠抗人 Cyclin D1 抗體（1 ∶200）與 GAPDH 一抗（1 ∶6000），4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶共價(jià)的二抗（1∶2000）。最后于暗室中以ELC 發(fā)光試劑盒顯影，以GADPH 為參照，采用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)觀察 HEC-1-B 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白 WB 染色條帶，Quantity One 1-D分析軟件進(jìn)行定量，分析 MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)量，以目的蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞增殖抑制率的影響

低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組HEC-1-B 細(xì)胞增殖抑制率均隨姜黃素濃度增大及作用時(shí)間延長呈逐漸升高趨勢(shì)，且組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05）。見表 1。

表1 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞增殖抑制率的影響（，%）

表1 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞增殖抑制率的影響（，%）

與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較*P<0.05；與中劑量實(shí)驗(yàn)組比較#P<0.05

組別 n 24 h 36 h 48 h F 值 P 值對(duì)照組 24 - - - - -低劑量實(shí)驗(yàn)組 24 14.98±2.46 26.97±2.87 39.01±3.03 442.872 <0.001中劑量實(shí)驗(yàn)組 24 28.54±3.12* 41.65±3.29* 56.99±4.12* 388.968 <0.001高劑量實(shí)驗(yàn)組 24 59.84±4.06*# 71.01±4.65*# 83.25±4.74*# 162.965 <0.001 F 值 - 1181.043 889.904 728.723 - -P 值 - <0.001 <0.001 <0.001 - -

2.2 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞侵襲能力的影響

低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)量及侵襲率均隨姜黃素作用濃度增大呈逐漸降低趨勢(shì)，兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均低于對(duì)照組（P 均<0.05）。見表 2、圖 1。

表2 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞侵襲能力的影響（）

表2 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞侵襲能力的影響（）

與對(duì)照組比較▲P<0.05；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較*P<0.05；與中劑量實(shí)驗(yàn)組比較#P<0.05

組別 n 侵襲細(xì)胞數(shù)量/個(gè) 侵襲率/%對(duì)照組 3 310.81±20.12 84.25±4.95低劑量實(shí)驗(yàn)組 3 221.96±14.09▲ 63.11±4.03▲中劑量實(shí)驗(yàn)組 3 193.64±12.34▲* 45.03±4.21▲*高劑量實(shí)驗(yàn)組 3 89.47±5.11▲*# 24.15±2.03▲*#F 值 - 127.693 125.868 P 值 - <0.001 <0.001

2.3 姜黃素對(duì)HEC-1-B 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9及Cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響

WB 檢測(cè)顯示，對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組HEC-1-B 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢(shì)，低、中和高劑量實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，且兩兩之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05）。見表3、圖2。

表 3 姜黃素對(duì) HEC-1-B 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（）

表 3 姜黃素對(duì) HEC-1-B 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響（）

與對(duì)照組比▲P<0.05；與低劑量實(shí)驗(yàn)組相比*P<0.05；與中劑量實(shí)驗(yàn)組相比#P<0.05

組別 n MMP-2 MMP-9 Cyclin D1對(duì)照組 24 0.96±0.04 0.91±0.04 0.92±0.05低劑量實(shí)驗(yàn)組 24 0.79±0.03▲ 0.70±0.02▲ 0.66±0.04▲中劑量實(shí)驗(yàn)組 24 0.62±0.02▲* 0.49±0.03▲* 0.43±0.02▲*高劑量實(shí)驗(yàn)組 24 0.37±0.03▲*# 0.24±0.01▲*# 0.31±0.02▲*#F 值 - 1600.842 2633.6 1419.755 P 值 - <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

細(xì)胞增殖、凋亡失衡是導(dǎo)致惡性腫瘤形成的機(jī)制之一，其中增殖率與腫瘤生長、遷移、侵襲能力均密切相關(guān)[8-9]。近年來，諸多研究報(bào)道，姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的體外抗腫瘤作用顯著，且毒性低，耐受性良好。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，姜黃素可通過阻礙腫瘤細(xì)胞進(jìn)行正常的有絲分裂，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。Qu 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可通過干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，將卵巢癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞增殖率是反映腫瘤生物學(xué)活性的有效指標(biāo)，且增殖是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的基礎(chǔ)，顏泉[12]研究報(bào)道，姜黃素可抑制人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS 和MG-63 增殖，降低其侵襲能力；劉俊香[13]研究稱，姜黃素可有效抑制非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并通過抑制E-cadherin、MMP-9 蛋白表達(dá)，有效削弱其侵襲能力。本研究中低/中/高劑量實(shí)驗(yàn)組織增殖抑制率逐漸升高，而細(xì)胞侵襲數(shù)量、侵襲率較逐漸降低，且均低于對(duì)照組，呈現(xiàn)劑量依賴性，提示姜黃素可有效抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞增殖，且其增殖抑制作用具有明顯時(shí)間-劑量依賴性，可有效削弱其侵襲能力，減少其惡性生物學(xué)行為。

Cyclin D1 是細(xì)胞周期啟動(dòng)因子，但其表達(dá)上調(diào)時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞周期從G1 期快速進(jìn)入到S期，進(jìn)而縮短細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，且羅藝洪等[14]研究報(bào)道，miR-200 b 可通過下調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)及，上調(diào)p21 蛋白表達(dá)發(fā)揮抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞增殖的目的。細(xì)胞外基質(zhì)降解是腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的重要信號(hào)與途徑，其中MMP-2、MMP-9 在子宮內(nèi)膜癌惡性生物學(xué)行為中具有重要意義；楊艷等[15]研究報(bào)道，EGFR 過表達(dá)可下調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞MMP-2 及MMP-9 蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。目前關(guān)于姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 及Cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響尚未見到報(bào)道。本研究中對(duì)照組、低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組HEC-1-B 細(xì)胞 MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均呈逐漸降低趨勢(shì)，且低/中/高劑量實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，提示姜黃素抗子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞增殖及侵襲的作用機(jī)制與其有效下調(diào) MMP-2、MMP-9 及 Cyclin D1 蛋白表達(dá)相關(guān)。

綜上，姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B 細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用，且可有效削弱其侵襲能力，其作用機(jī)制與其有效抑制MMP-2、MMP-9及Cyclin D1 蛋白表達(dá)相關(guān)，體外抗子宮內(nèi)膜癌效果顯著。姜黃素有望成為子宮內(nèi)膜癌的治療新藥，但有關(guān)其抗腫瘤效果需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證，且其具體抗腫瘤分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。