肌萎縮側(cè)索硬化患者腦脊液及血清中巨噬細胞炎性蛋白-1α水平的臨床研究

楊璇，臧大維

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)是一種進展性、致命性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要影響上、下運動神經(jīng)元，導(dǎo)致患者肌無力、肌萎縮、肌束顫動等，大多數(shù)患者在診斷2～5年內(nèi)由于呼吸道感染、褥瘡、呼吸肌麻痹等并發(fā)癥而死亡，至今仍缺乏有效的的診斷及治療方法。近年來，越來越多的研究者關(guān)注ALS的生物標志物研究，從而深入了解其發(fā)病機制，幫助早期診斷及治療。生物標志物在基因、蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物等領(lǐng)域發(fā)展迅速，尤其是細胞因子和趨化因子的研究，比如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[1]、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)[2]、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)[3]等被認為在ALS某些階段發(fā)揮重要作用。巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)是CNS炎癥反應(yīng)中最常見的趨化因子之一，是CC類趨化因子的成員之一，又被稱為CC趨化因子配體3(CCL3)，它通過激活其受體CCR1和CCR5發(fā)揮作用[4]。MIP-1α是促炎性趨化因子，其關(guān)鍵功能是促進白細胞聚集至炎癥部位。目前MIP-1α已被證明不僅與CNS自身免疫性疾病相關(guān)，還與Alzheimer’s病、帕金森病、創(chuàng)傷性腦損傷等炎癥機制相關(guān)的疾病存在關(guān)聯(lián)[5-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)ALS患者CSF中MIP-1α水平明顯升高[9]，但MIP-1α與疾病進展及預(yù)后的潛在關(guān)系尚不清楚。本研究旨在明確ALS患者CSF及血清MIP-1α水平是否升高，并探討MIP-1α水平與各項臨床指標，如病程、疾病進展率、神經(jīng)功能缺損評分及生存預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 納入2006年10月至2017年10月就診于我院門診及住院的ALS患者共70例為ALS組，其中男性36例，女性34例，平均年齡為(56.86±9.49)歲，平均病程為(27.10±25.35)個月。ALS患者均由臨床經(jīng)驗豐富的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師依據(jù)修訂的 EI Escorial ALS臨床診斷標準[10]明確診斷。排除標準：合并嚴重的心、肝、腎功能損害者、呼吸衰竭、嚴重的肺感染的患者；合并腦卒中病史、糖尿病周圍神經(jīng)病變及任何損害運動神經(jīng)元而可能混淆 ALS 診斷的疾病患者；納入病例組時正在服用任何藥物的患者。納入同期住院的非炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者作為對照組，包括低顱壓頭痛、CSF漏等。對照組患者共51例，其中男性24例，女性27例，平均年齡為(56.94±10.17)歲。排除標準：合并嚴重的心、肝、腎功能損害者、呼吸衰竭、嚴重的肺感染的患者；正在服用任何藥物，尤其是抗炎藥物的患者。本研究由醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組患者均簽署實驗知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ALS患者評估及隨訪方法 通過改良版ALS功能評分量表(ALSFRS-r)對ALS患者的神經(jīng)功能缺損情況進行評估，ALSFRS-r量表總分48分，得分越高，說明ALS患者整體神經(jīng)功能受損越輕微，反之則患者神經(jīng)功能缺損越嚴重。應(yīng)用疾病進展率(DPR)評估ALS患者的疾病進展情況，計算公式為：DPR=48-診斷時ALSFRS-r評分/病程(月)，DPR值越大，疾病進展越快，反之則疾病進展越緩慢。此外，本研究通過電話或門診成功隨訪入組ALS患者48例，詳細記錄其生存狀態(tài)。

1.2.2 標本采集 應(yīng)用標準的腰椎穿刺術(shù)留取70例ALS患者及51例對照組患者的CSF，并立即離心和分裝上清液，置于-80 ℃冰箱保存待檢。所有入組的患者于空腹行靜脈穿刺術(shù)抽取非抗凝血，離心并分裝上層血清，置于-80 ℃冰箱保存待檢。所有標本均在6個月內(nèi)檢測完畢。

1.2.3 ELISA法檢測MIP-1α水平 CSF及血清中MIP-1α水平由ELISA檢測，所使用的MIP-1α ELISA測試劑盒購于美國R&D公司，具體方法嚴格按照說明書進行。本研究所有標本檢測均做復(fù)孔，取平均值為研究數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 ALS患者和對照組人口學特征及臨床評估數(shù)據(jù)的比較 見表1。

表1 ALS組和對照組基本臨床資料的比較(x±s)項目ALS組對照組例數(shù)7051性別 (男/女)36/3424/27年齡 (歲)56.86±9.4956.94±10.17標本例數(shù) (CSF/血清)49/7051/51首發(fā)部位 肢體46- 延髓15-兩者均有9-體質(zhì)量指數(shù)(BMI)23.99 ±3.68-病程 (個月)27.10±25.35-ALSFRS-r評分35.49±6.00-DPR0.78±0.67-

2.2 ALS組和對照組患者MIP-1α水平的比較 ALS組CSF的MIP-1α水平[(303.97±50.46)pg/ml]明顯高于對照組[(181.39±59.87)pg/ml](P<0.05)，ALS組血清MIP-1α水平[(346.80±65.98)pg/ml]明顯高于對照組[(186.51±45.07)pg/ml](P<0.05)。

2.3 ALS組MIP-1α水平與臨床指標的相關(guān)性分析

ALS組CSF中MIP-1α與病程呈正相關(guān)(r=0.5070，P=0.0002)，與DPR呈負相關(guān)(r=-0.4760，P=0.0005)，與ALSFRS-r評分無明顯相關(guān)性(r=0.0260，P=0.8600)；ALS組血清MIP-1α與病程呈正相關(guān)(r=0.4270，P=0.0002)，與DPR呈負相關(guān)(r=-0.490，P<0.0001)，與ALSFRS-r評分無明顯相關(guān)性(r=0.0530，P=0.6630)。

2.4 MIP-1α水平對ALS患者的累積生存分析 見圖1。本研究成功隨訪入組ALS患者48例，根據(jù)血清MIP-1α水平，將MIP-1α水平高于中位數(shù)(≥346.80 pg/ml)患者定義為H group，低于中位數(shù)定義為L group。Kaplan-Meier生存分析顯示，MIP-1α水平高于平均值的ALS患者，其累積生存率明顯高于MIP-1α水平低于平均值的ALS患者(P=0.0031)。

圖1 MIP-1α水平對ALS患者的累積生存分析

2.5 ALS患者生存預(yù)后影響因素的Cox多因素分析

見表2。將性別、年齡、首發(fā)部位、BMI、病程、DPR、ALSFRS-r評分、血清中MIP-1α水平、CSF中MIP-1α水平納入Cox多因素分析模型，結(jié)果顯示，血清MIP-1α水平是ALS患者生存預(yù)后的影響因素。

表2 ALS患者生存預(yù)后影響因素的Cox多因素分析影響因素OR值95%CIP值性別1.2750.370～4.4000.700年齡1.0390.982～1.0990.180首發(fā)部位 肢體1 延髓2.4270.554～10.6410.240 二者均有2.2510.296～17.1170.433BMI1.1490.970～1.3610.109病程0.9540.893～1.0190.161ALSFRS-r評分0.9440.834～1.0700.368DPR0.9050.287～2.8530.864血清中MIP-1α水平0.9800.969～0.9910.001CSF中MIP-1α水平0.9940.977～1.0110.510

3 討 論

本研究應(yīng)用ELISA檢測血清和CSF中MIP-1α的水平，分析MIP-1α與ALS患者各項臨床指標及生存預(yù)后的關(guān)系。主要結(jié)果如下：(1)ALS患者MIP-1α的水平較對照組明顯升高；(2)ALS患者的MIP-1α水平與病程呈明顯正相關(guān)，與疾病進展率呈明顯負相關(guān)；(3)MIP-1α水平高于平均值的ALS患者，其累積生存率明顯高于MIP-1α水平低于平均值的ALS患者；(4)Cox多因素分析結(jié)果顯示，血清MIP-1α水平是ALS患者生存預(yù)后的影響因素。以上研究結(jié)果提示，MIP-1α水平越高，ALS患者的病程越長，疾病進展率越低，進展越緩慢，累積生存率也越高，MIP-1α可能是預(yù)測疾病進展及生存預(yù)后的生物標志物之一。

MIP-1α對于誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞聚集至關(guān)重要，而這種活化的小膠質(zhì)細胞會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并在多種炎癥因子的合成和釋放中發(fā)揮重要作用[11-13]。近年來，CNS炎癥反應(yīng)被認為是ALS發(fā)病的關(guān)鍵機制之一[14]。當ALS患者的炎癥機制啟動，炎癥介質(zhì)的釋放會增加，MIP-1α作為最常見的炎癥趨化因子，必然會明顯升高并參與到機體炎癥反應(yīng)中。

MIP-1α是一種促炎性趨化因子，曾有研究認為這種促炎性趨化因子對機體發(fā)揮有害的影響。Tonges等[15]將MIP-1α作為一種研究指標去評估 ROCK 抑制劑法舒地爾對ALS的神經(jīng)保護作用，若法舒地爾干預(yù)后，MIP-1α等一系列促炎性因子水平降低，則說明法舒地爾對 ALS 具有一定的治療效果，故研究者們將MIP-1α作為有害因子去評估藥物的療效。此外，有研究發(fā)現(xiàn) MIP-1α可能會加速Alzheimer’s病患者非認知功能癥狀的進展[16]。

然而本研究結(jié)果顯示，MIP-1α水平越高，ALS患者的病程越長，疾病進展率越低，疾病進展越緩慢，累積生存率也越高。面對不同研究結(jié)果的差異，分析如下：首先，MIP-1α在ALS發(fā)病機制中可能發(fā)揮雙向的炎性作用，它可能在疾病早期參與炎癥反應(yīng)，并發(fā)揮其促炎性作用，而在疾病不斷的進展中發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。其次，目前尚無明確研究解釋MIP-1α及炎癥機制對ALS患者的確切影響，且MIP-1α的具體作用信號通路尚不明確。再次，許多炎癥反應(yīng)也被認為對機體有益。此外，Tateishi 等[17]研究表明MIP-1β在 ALS 患者中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。MIP-1β與MIP-1α具有共同的受體CCR5[5]，盡管趨化因子與其受體間的關(guān)系相當復(fù)雜，但我們猜測MIP-1β與MIP-1α對 ALS 患者發(fā)揮作用可能為同樣的信號通路及作用機制，故MIP-1α對 ALS 也可能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

研究中的Cox多因素分析顯示，血清MIP-1α水平是ALS患者生存預(yù)后的影響因素。血清MIP-1α比CSF MIP-1α更有預(yù)后意義，結(jié)合研究結(jié)果，血清中MIP-1α水平較CSF高，故當機體炎癥反應(yīng)啟動時，血清中炎癥因子較CSF更快速更明顯升高，可能為更敏感的臨床標志物之一；此外，研究中采集血清及CSF的時機為ALS患者確診時，也就是疾病發(fā)展的早期，可能此時炎癥反應(yīng)在CNS并未完全激活，故外周血的炎癥因子更有意義。但是，血清中比CSF包含更多的細胞因子及趨化因子，更容易受到全身系統(tǒng)性疾病的影響，因此未來將納入更多的病例，包括不同進展時期的標本去驗證本研究結(jié)果。

面對如此復(fù)雜的疾病，做到準確的早期診斷非常困難，也無特異性的診斷試驗，更無有效的治療措施去改善患者神經(jīng)功能缺損的狀況，故一種可靠的生物標志物不僅僅幫助我們早期診斷疾病，更有可能揭示發(fā)病機制，甚至提供治療新策略。本研究證明，MIP-1α對于ALS疾病進展及預(yù)后的潛在意義，提示MIP-1α可能對ALS發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但本研究仍存在一些局限性：第一，本研究納入的病例數(shù)較少，且并不是所有入組的ALS患者均留取了CSF標本；第二，本研究納入的是中國散發(fā)性ALS患者，也就是亞裔人群，故并不能代表整個ALS人群，其研究結(jié)果也并不一定適用于其他種族ALS以及家族性ALS； 此外，入組ALS患者的ALSFRS-r評分大多數(shù)高于30分，意味著入組ALS患者癥狀相對較輕，神經(jīng)功能缺損程度相對不重。在未來進一步研究中，將納入一部分癥狀嚴重的患者，納入更廣泛種類的ALS 病例。

本研究結(jié)果表明，ALS患者CSF及血清中MIP-1α水平均明顯升高，且與疾病病程、進展及生存預(yù)后相關(guān)，MIP-1α可能為ALS一種具有神經(jīng)保護作用的生物標志物。未來研究應(yīng)關(guān)注ALS相關(guān)機制，探索MIP-1α介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的機制及信號通路。為了更有力地證實MIP-1α的神經(jīng)保護作用，促進未來更廣范圍的臨床應(yīng)用，本研究小組將開展更大規(guī)模的病例對照研究以及一系列前瞻性研究，以助于發(fā)現(xiàn) ALS 可靠的生物標志物，早日將基礎(chǔ)實驗成果應(yīng)用于臨床實踐。