檸檬醛抑制真菌作用的研究進展及其在食品防霉中的應(yīng)用前景

張晶晶，彭銳，杜春貴，滑亞婷，黃秋麗，姚瀟翎

(浙江農(nóng)林大學(xué) 工程學(xué)院，杭州 311300)

食品安全問題已經(jīng)是一個全世界都關(guān)注的問題，其中真菌及其產(chǎn)生的次級代謝物真菌毒素引起的食品安全問題日益嚴(yán)重[1]。據(jù)報道，每年約有10億噸農(nóng)業(yè)產(chǎn)品受到真菌及真菌毒素的污染[2]，導(dǎo)致了資源和經(jīng)濟的損失，而且由于真菌毒素極強的急性毒性、致畸性、致癌性、致突變性等，將會對人類的身體健康和生命安全造成嚴(yán)重威脅[3]。因此，亟待大力研發(fā)防霉劑，解決真菌霉變問題。目前，國內(nèi)外研發(fā)的食品防霉劑大多為化學(xué)藥劑，雖然防霉效果好，但由于化學(xué)抗菌劑的安全性受到挑戰(zhàn)，天然抗菌物憑借著具有化學(xué)合成劑無法比擬的安全優(yōu)勢，越來越被推崇[4-6]。因此，研發(fā)新型環(huán)保防霉劑取代化學(xué)防霉劑將成為必然。

近年來，由于植物源性防霉劑具有抑菌活性強、抑菌譜廣、對環(huán)境友好、對人體相對安全等優(yōu)點，逐漸成為植物性天然抗菌劑研究的熱點，其中，關(guān)注較多的是一些具有較強抗菌防霉活性的中草藥。作為中藥山蒼子精油主要成分的檸檬醛，因具有較強的抑菌性能[7]，目前正在引起學(xué)者的研究興趣。且我國的中藥山蒼子精油產(chǎn)量居世界第一，故研制檸檬醛類抗菌劑，來源廣、成本低、綠色、安全，必將有著廣闊的研發(fā)與應(yīng)用前景。為此，本文綜述了近年來國內(nèi)外有關(guān)檸檬醛抑菌性能、抑菌機理等的研究進展，并對其在食品霉菌防治中的應(yīng)用前景進行了展望，可為檸檬醛在食品領(lǐng)域中的抗菌防霉研究與應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 檸檬醛對青霉菌的抑制作用

青霉菌是青霉屬真菌的一種，極易侵染柑橘等物質(zhì)導(dǎo)致其霉變腐爛[8]。目前，有少量檸檬醛對青霉菌抑制的相關(guān)研究報道。

1.1 檸檬醛對青霉菌細(xì)胞形態(tài)的影響

Tao等[9,10]通過對柑桔精油和檸檬醛對意大利青霉和指狀青霉的抗真菌活性以及抗真菌作用機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)檸檬醛可以通過引起細(xì)胞質(zhì)的丟失，以及菌絲的變形而明顯改變意大利青霉菌菌絲的形態(tài)。檸檬醛對意大利青霉形態(tài)影響的掃描電鏡(SEM)見圖1。

圖1 檸檬醛對意大利青霉菌絲體形態(tài)的影響Fig.1 Effect of citral on the morphology of Penicillium italicum mycelium

由圖1可知，未經(jīng)檸檬醛處理的對照菌的菌絲正常、管狀、規(guī)則、均質(zhì)(見圖1中 a)。經(jīng)檸檬醛最小抑菌濃度(MIC)處理4 d后，意大利青霉菌的菌絲表面呈疣狀(見圖1中b)。而經(jīng)檸檬醛最小殺菌濃度(MFC)處理4 d后，意大利青霉菌的菌絲因缺乏細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重塌陷(見圖1中c和d)，且菌絲萎縮變形(見圖1中c)。

為了進一步闡明檸檬醛的殺傷機制，Tao采用透射電鏡(TEM)對經(jīng)MIC和MFC處理的青霉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響進行了分析，結(jié)果見圖2。

圖2 檸檬醛對意大利青霉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.2 Effect of citral on cellular ultrastructure of Penicillium italicum

由圖2可知，未經(jīng)檸檬醛處理的意大利青霉菌的細(xì)胞表面光滑致密(見圖2中a)，而經(jīng)檸檬醛處理后的意大利青霉菌的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化 (見圖2中b和c)。其中，檸檬醛MIC明顯誘導(dǎo)了菌絲抑制的形成(見圖2中b)，而檸檬醛MFC則破壞了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)丟失，大量物質(zhì)從細(xì)胞壁外擠壓而出(見圖2中c)。

1.2 檸檬醛對青霉菌細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)成分的影響

陶能國等[11,12]研究表明檸檬醛處理可導(dǎo)致細(xì)胞總MDA和H2O2增加(見圖3)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，細(xì)胞的總脂質(zhì)和麥角甾醇含量降低(見圖4)，從而誘導(dǎo)青霉菌絲體發(fā)生嚴(yán)重的膜脂過氧化損傷，增加細(xì)胞膜通透性，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，達(dá)到抑制青霉菌生長的作用。

圖3 檸檬醛對指狀青霉總MDA和H2O2含量的影響Fig.3 Effect of citral on the total MDA and H2O2 content of Penicillium digitatum

圖4 檸檬醛對意大利青霉細(xì)胞總脂質(zhì)含量(a)和麥角甾醇含量(b)的影響Fig.4 Effect of citral on the total lipid content (a) and ergosterol content (b) of Penicillium italicum cells

同時陶能國、歐陽秋麗等[13]的研究表明，檸檬醛既能破壞青霉菌細(xì)胞膜，又會影響青霉菌的一些代謝途徑，從而使細(xì)胞不能進行正常生命活動。檸檬醛對青霉菌起破壞作用的方式主要有：(1)檸檬醛能通過大量積累活性氧破壞指狀霉菌的氧化磷酸化和細(xì)胞膜，抑制指狀霉菌的生長；(2)通過破壞指狀青霉線粒體外膜和內(nèi)膜，改變其選擇通透性，從而影響線粒體內(nèi)外物質(zhì)的輸送；(3)通過降低呼吸代謝對氧的利用率，從而使 ATP 含量減少；(4)通過直接影響糖酵解途徑(如改變指狀青霉糖酵解途徑關(guān)鍵酶的活性，見圖5)、重要中間產(chǎn)物的含量和TCA途徑。

圖5 檸檬醛對指狀青霉丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)活性的影響Fig.5 Effect of citral on PK，PFK，HK activity of Penicillium digitatum

綜上所述，檸檬醛處理青霉菌后，不僅改變了青霉菌菌絲形態(tài)、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)，而且破壞了細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞膜通透性以及細(xì)胞代謝途徑，從而起到抑菌作用。

2 檸檬醛對曲霉菌的抑制作用

曲霉菌是廣泛存在于自然界中的一種深部條件致病性絲狀真菌[14]。有的能產(chǎn)生對人體有害的真菌毒素，有的則引起水果、蔬菜、糧食霉腐。因此，國內(nèi)外學(xué)者對利用防霉劑殺死曲霉菌進行了大量研究，其中有部分檸檬醛作為殺菌劑的相關(guān)研究報道。

2.1 檸檬醛對曲霉菌細(xì)胞形態(tài)的影響

研究表明[15-17]用檸檬醛處理曲霉后，曲霉會發(fā)生以下變化：菌絲扭曲、欲折、分枝少；分生孢子梗萎縮，表面光滑；細(xì)胞體積減小，表面凹陷，細(xì)胞壁厚度減小，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞漿的缺損和疏松，線粒體解體，不規(guī)則線粒體數(shù)量增多并聚集等。

羅曼等[18]采用檸檬醛蒸汽與溶液對黃曲霉孢子進行處理，并通過透射電鏡觀察了黃曲霉孢子的顯微結(jié)構(gòu)變化。檸檬醛蒸汽對黃曲霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響見圖6。

圖6 黃曲霉孢子經(jīng)檸檬醛同分異構(gòu)體蒸汽處理后透射電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 The microstructure of Aspergillus flavus spores after citral isomer steam treatment under TEM

由圖6可知，孢子細(xì)胞壁形態(tài)變化不明顯，細(xì)胞漿內(nèi)物質(zhì)聚集明顯。與對照組比較，處理組細(xì)胞壁變薄且凹凸不平，部分區(qū)域皺縮；但周質(zhì)空間(細(xì)胞質(zhì)膜與細(xì)胞之間的空隙)的電子密度沒有明顯改變。此外，處理組胞漿內(nèi)物質(zhì)也明顯不如對照組的分布均勻，有區(qū)域化聚集趨勢。檸檬醛溶液處理對黃曲霉孢子超微結(jié)構(gòu)的影響見圖7。

圖7 黃曲霉孢子經(jīng)檸檬醛同分異構(gòu)體溶液處理后透射電鏡下的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 The microstructure of Aspergillus flavus spores after citral isomer solution treatment under TEM

由圖7可知，與對照組相比，經(jīng)過檸檬醛溶液處理的實驗組細(xì)胞壁嚴(yán)重皺縮并多處突起；周質(zhì)空間的電子密度大大增強，細(xì)胞膜清晰且在部分區(qū)域出現(xiàn)與胞質(zhì)分離現(xiàn)象；細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的固縮化，出現(xiàn)不規(guī)則的固形物。

2.2 檸檬醛對曲霉菌細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)成分的影響

研究表明檸檬醛處理曲霉能改變其膜的物理參數(shù)(見表1)[19]，進而改變其質(zhì)膜的分子結(jié)構(gòu)。蔣立科等[20]研究了檸檬醛作用于曲霉的動靜態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)該醛能使黃曲霉中的有些大分子失去正常結(jié)構(gòu)，改變其功能，影響相關(guān)的調(diào)節(jié)機制，進而殺死曲霉。

表1 受損黑曲霉質(zhì)膜的粘彈性參數(shù)Table 1 The viscoelasticity parameters of damaged Aspergillus niger plasmalemma

吳子健等[21]研究表明檸檬醛處理會破壞曲霉氧化還原系統(tǒng)和細(xì)胞能量代謝途徑，如可以通過降低黃曲霉細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶(SDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)的活力(見表2和表3)影響曲霉的TCA循環(huán)，從而進一步影響細(xì)胞能量代謝途徑。

表2 檸檬醛對SDH活力的影響Table 2 The effect of citral on SDH activity

表3 檸檬醛對胞液內(nèi) MDH 活力的影響(以 NADP+為輔酶)Table 3 The effect of citral on MDH activity in cytosol (with NADP+ as coenzyme)

也有研究表明檸檬醛會使細(xì)胞內(nèi)Ca2+、K+、Mg2+滲漏量增加，總脂質(zhì)含量下降，飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸增加，并影響曲霉菌的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，見表4。

表4 檸檬醛對曲霉菌3種同位素標(biāo)記前體摻入抑制率Table 4 Inhibition rate of citral on three isotope labeled precursors of Aspergillus

綜上所述，檸檬醛處理曲霉菌后，不僅改變了曲霉菌菌絲形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)，而且破壞了細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞膜通透性、膜的物理參數(shù)以及細(xì)胞代謝途徑，從而起到抑制曲霉的作用。

3 檸檬醛對木霉菌的抑制作用

木霉菌是食用菌生產(chǎn)中一個主要的競爭性雜菌和病原菌[22]，不僅會導(dǎo)致食用菌已滅菌培養(yǎng)料或發(fā)酵料受到污染，而且感染雙孢蘑菇、平菇等菌絲體，引起菌袋或菌棒中菌絲體凋亡，造成極為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[23-25]。目前，有少量檸檬醛對木霉菌抑制作用的研究報道。

林群英等[26]對4種植物精油抑制黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、綠色木霉和木霉等病原真菌的效果進行分析，并以金針菇為材料進行初步保鮮效果評價。研究結(jié)果顯示：檸檬醛對產(chǎn)黃青霉及木霉的抑制率最高。郭丹等[27]通過對山蒼子油主成分檸檬醛、香茅醛及其衍生物共 10種化合物對綠色木霉抑制活性進行分析，結(jié)果顯示這些化合物對綠色木霉有一定的抑制作用。而且經(jīng)化合物處理后，菌液相對滲透率均有所增大，說明上述化合物造成菌體細(xì)胞膜的破壞是其抑菌作用原因之一。

4 檸檬醛對其他真菌的抑制作用

目前，有關(guān)檸檬醛對真菌抑制作用的研究，主要集中在上述3種真菌上。除此之外，還有少數(shù)有關(guān)犬白色念珠菌、白假絲酵母等真菌的研究。

孫博等[28]對肉桂醛、檸檬醛在真菌黏附口腔黏膜上皮以及對犬白色念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響進行探索。結(jié)果表明，藥物處理后白色念珠菌黏附率顯著下降，而且細(xì)胞表面粗糙、皺縮、萎陷、外膜空洞、胞漿內(nèi)容物流出、細(xì)胞壁增厚、質(zhì)壁分離、梁青等[29]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子油具有優(yōu)良的抗白假絲酵母活性，且白假絲酵母在芽痕處對山蒼子油比較敏感，高濃度的精油(5.0 μL/mL)對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆破壞；而且山蒼子油殺菌的靶標(biāo)可能是細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，使細(xì)胞內(nèi)大分子外泄，細(xì)胞器變形，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

5 檸檬醛在食品防霉中的應(yīng)用前景

目前，檸檬醛抑制真菌作用的研究取得了一定成果，但其研究主要集中在對體外真菌的抑制效果和少量抑菌機理等方面，有關(guān)檸檬醛的應(yīng)用研究，特別是在食品中的防霉研究與應(yīng)用仍然較少，檸檬醛抑菌機理的研究仍有待加強。展望未來，檸檬醛將在食品領(lǐng)域的防霉研究與應(yīng)用中具有廣闊的發(fā)展前景。

5.1 糧食防霉

糧食在儲藏過程中，受溫濕度、含水量等因素影響，極易產(chǎn)生霉變。真菌是糧食霉變的關(guān)鍵“殺手”，如灰綠曲霉、黃曲霉、青霉等[30]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估算， 每年大約有5%～7%的糧食、飼料等農(nóng)作物產(chǎn)品受霉菌污染，所造成的經(jīng)濟損失可達(dá)數(shù)千億美元。而且霉菌產(chǎn)生的毒素會使人與動物中毒，威脅人類身體健康，尤其黃曲霉毒素危害最為嚴(yán)重[31]，因此，采取措施解決糧食霉變問題至關(guān)重要。而現(xiàn)在防止糧食霉變的解決措施主要有物理方法和添加化學(xué)藥劑法。但物理防霉見效慢、效果差，而化學(xué)藥品例如磷化鋁、芳香烴、有機酸類等的使用會帶來很多副作用，如：化學(xué)毒性殘留、環(huán)境二次污染、真菌產(chǎn)生抗藥性，這些給糧食的安全儲藏帶來了潛在威肋[32]。因此，開發(fā)安全、高效、綠色的天然糧食防霉劑取代化學(xué)防霉劑成為必然趨勢，而檸檬醛作為一種天然抗菌劑，必將在糧食的防霉中發(fā)揮重要作用。

5.2 果蔬防霉

據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，現(xiàn)階段我國新鮮果蔬的腐爛損耗率在 30%～50%之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于發(fā)達(dá)國家平均損耗率7%的水平[33]。造成果蔬腐爛的主要原因是真菌的感染，影響果蔬的食用價值、感官價值及經(jīng)濟價值，甚至對人體健康及環(huán)境安全產(chǎn)生影響。因此，解決果蔬霉變問題十分重要。長期以來人們多采用低溫、氣調(diào)、減壓等處理方法配合化學(xué)藥劑或者香料涂膜來防治，而化學(xué)藥劑的使用不僅會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且會增加果蔬農(nóng)藥殘留量，危害人類健康[34,35]。相比之下，植物源防霉劑在人體消化道內(nèi)可降解，不影響消化道菌群和藥用抗菌素的使用[36]，而且安全無毒，具有一定的生理活性。因此，檸檬醛防霉劑的研究與開發(fā)對促進果蔬產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

續(xù) 表

5.3 食用菌防霉

在食用菌栽培過程中，經(jīng)常發(fā)生霉菌污染，霉菌大多數(shù)能夠降解和吸收纖維素，從而影響食用菌的產(chǎn)量，進而增加食用菌的生產(chǎn)成本[37]。因此，有效抑制霉菌生長是食用菌栽培成功的重要因素。所以，為了抑制霉菌污染，在栽培中往往需要在生料拌料時加入抑菌劑，如多菌靈、克霉靈、代森錳鋅等化學(xué)藥劑，但這些化學(xué)抑菌劑會造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留和增加抗藥性，不利于食用菌的菌絲生長，影響食用菌的品質(zhì)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，同時增加成本[38,39]。因此，需要尋找更加安全、高效且成本低的新型抑菌劑來解決這些問題。而檸檬醛類抗菌劑抑菌譜廣、來源足、成本低、綠色、安全，將會為食用菌栽培過程中的防霉環(huán)節(jié)做出突出貢獻。