醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥性及其耐藥基因分析

陳 娜， 張峰波， 周鵬鵬， 季 萍

耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE），特別是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CR-KP）在臨床分離株中檢出率逐年增高，造成患者嚴(yán)重的感染和更高的病死率[1]。我國(guó) CHINET 細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，CR-KP流行存在明顯的地域性差異。有報(bào)道，產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的克隆傳播是一些地區(qū)肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的重要原因[2]。因編碼碳青霉烯酶的基因可位于基因組（染色體）的DNA上，也可位于質(zhì)粒上，并可通過質(zhì)粒進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，因此在同一醫(yī)院的同一病區(qū)更易發(fā)生CR-KP的克隆傳播。為了解新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)（ICU）肺炎克雷伯菌的耐藥性特征以及有無CR-KP克隆株的傳播，為其感染控制及合理應(yīng)用抗菌藥物提供依據(jù)，本研究回顧性收集和分析了2014－2018年分離自ICU住院患者的肺炎克雷伯菌及耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，并對(duì)2018年5－7月呼吸ICU（RICU）8例患者送檢標(biāo)本中分離的12株CR-KP及其環(huán)境中分離的3株CR-KP菌株進(jìn)行耐藥基因與同源性分析研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病史資料、菌株來源 患者病史資料源自于醫(yī)院的電子病歷系統(tǒng)。收集2014－2018年我院微生物室分離自ICU住院患者送檢的臨床標(biāo)本中的肺炎克雷伯菌1 580株（剔除同一患者的重復(fù)菌株），臨床主要標(biāo)本中痰液占82.0%、尿液占5.4%、引流液占4.3%和血液占3.9%。其中2018年5－7月自RICU 8例患者送檢標(biāo)本中分離出12株CR- KP、環(huán)境中分離出3株CR-KP。本研究質(zhì)控菌株有肺炎克雷伯菌 ATCC 700603、ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706。

1.1.2 試劑與儀器 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀 VITEK 2-Compact 60購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；VITEK 2 AST-GN09、VITEK 2 AST-GN16卡、MH培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；紙片擴(kuò)散法（K-B）亞胺培南、美羅培南藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司或美國(guó)BBL公司；限制性內(nèi)切酶Xba I、Taq酶、高保真Taq酶、dNTP和DNA分子量標(biāo)志物購(gòu)自TaKaRa公司；脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）DNA Marker 購(gòu)于Pharmacia Biotech 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、低熔點(diǎn)瓊脂糖、高密度瓊脂糖、苯甲基磺酰氟（PMSF）、瓊脂糖、無水氯化鈣、溴化乙錠、溴酚藍(lán)等分子生物學(xué)試劑購(gòu)于上海Sangon公司，PCR擴(kuò)增儀購(gòu)于PE公司；CHEF Mapper XA型PFGE、核酸電泳儀及紫外線凝膠成像儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；恒溫水平搖床及雜交爐為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗(yàn) 用VITEK2 全自動(dòng)微生物分析儀和常規(guī)方法進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，選擇的抗菌藥物包括哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑。 對(duì)2018年5－7月RICU 8例患者送檢標(biāo)本中分離的12株CR-KP及環(huán)境中分離的3株CR-KP菌株采用肉湯微量稀釋法對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、替加環(huán)素等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；同時(shí)采用瓊脂稀釋法，增加頭孢他啶-阿維巴坦和磷霉素的藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果參照2018年版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判讀。WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)分析耐藥率。

1.2.2 耐藥基因的檢測(cè)和分子流行病學(xué)研究

1.2.2.1 PCR擴(kuò)增 本次研究的耐藥基因有：blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1、8、9、blaKPC-2、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaOXA-23、48。反應(yīng)體系[3]：P1和P2分別加入1 μL，MIX（含Mg2+，dNTP，TaqDNA聚合酶）12.5 μL；蒸餾水10.5 μL；DNA模板打孔加入。PCR擴(kuò)增條件，95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳后用Bio-Rad 凝膠成像儀檢測(cè)成像，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。引物參考既往合成特異性引物[4-5]。

1.2.2.2 PFGE同源性分析 對(duì)CR-KP進(jìn)行PFGE同源性分析[6]：以XbaⅠ作為核酸內(nèi)切酶，37 ℃酶切5～8 h；PFGE條件為0.5×TBE、14 ℃、6 V/cm電壓、120°電場(chǎng)夾角、電流轉(zhuǎn)換時(shí)間5～35 s、電泳22 h。用沙門菌H9812作為電泳結(jié)果對(duì)照。采用BioNumerics軟件對(duì)PFGE條帶進(jìn)行聚類分析。

1.2.2.3 多位點(diǎn)序列分型（MLST） 參照 MLST專業(yè)網(wǎng)站，即https：//www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html，設(shè)計(jì)gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB7對(duì)管家基因的引物，退火溫度均為50 ℃[6]，對(duì)PCR擴(kuò)增陽性的產(chǎn)物送往杭州鉑尚測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果在肺炎克雷伯菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定其序列型（ST型）。

1.2.3 相關(guān)定義 呼吸衰竭好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀好轉(zhuǎn)，血?dú)鉁y(cè)定值改善；肺炎好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)：體溫正常，癥狀明顯減輕，胸部X線檢查肺部病變吸收好轉(zhuǎn)；腸梗阻好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)[7]：癥狀體征改善明顯，X線提示腸梗阻基本解除；治療無效：癥狀體征未見改善，患者家屬放棄治療。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌的耐藥性及變遷

2.1.1 肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率 五年間我院ICU共檢出肺炎克雷伯菌1 580株，標(biāo)本來源主要為痰液（82.0%，1 296/1 580）、尿液（5.4%，86/1 580）、引流液（4.4%，69/1 580）和血液（3.9%，62/1 580）。1 580株肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥。2018年439株肺炎克雷伯菌中， ESBL的檢出率37.1%，對(duì)第三、第四代頭孢菌素的耐藥率為26.0%～37.1%、對(duì)哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率17.8%，對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥率為17.1%～19.0%，對(duì)慶大霉素和阿米卡星的耐藥分別為27.2%和11.6%。五年間對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率整體亦呈上升趨勢(shì)，其中亞胺培南、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦耐藥率分別從2014年的0.9%、1.1%、2.3%上升至2018年的17.1%、19.0%、17.8%。見表1。五年間CR-KP檢出率分別為3.6%、8.1% 、8.0%、8.4%和18.7%，顯示呈上升趨勢(shì)。

表1 2014－2018年分離自重癥監(jiān)護(hù)病區(qū)肺炎克雷伯菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility profiles of the Klebsiella pneumoniae strains isolated from intensive care unit from 2014 to 2018（%）

2.1.2 ICU CR-KP的檢出率 2014－2018年ICU共檢出165株CR-KP，其中以RICU檢出率最高（92株，55.8%）。標(biāo)本類型前4位為：痰液（70.0%）、尿液（11.0%）、支氣管吸出物（9.0%）、血液（4.0%）。檢出率總體呈上升趨勢(shì)，五年間每年的檢出率分別為3.6%（8/222）、8.1%（22/273）、8.0%（20/251）、8.4%（33/395）、18.7%（82/439）。

2.2 CR-KP感染患者的臨床特征、耐藥性及同源 性

2.2.1 CR-KP感染患者的臨床特征 2018年5－7月從RICU 8例患者送檢的標(biāo)本中分離出12株CRKP，其中1號(hào)患者為肺部感染、呼吸衰竭、不完全腸梗阻、腹膜炎，先從痰液、腹水標(biāo)本中分別分離出CR-KP，后繼發(fā)血流感染，相繼從血液和膽汁中分離出CR-KP；2號(hào)、5號(hào)患者為Ⅰ型呼吸衰竭、肺部感染，分別從尿中分離出CR-KP；3號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、8號(hào)為重癥肺炎、Ⅰ型呼吸衰竭，均從痰液中分離出CR-KP；7號(hào)患者為十二指腸惡性腫瘤、腸梗阻、感染性休克，先從引流液中分離出CR-KP，后繼發(fā)血流感染從血液中分離出CRKP。環(huán)境中的3株CR-KP是從1號(hào)患者的ICU單間的呼吸機(jī)表面、其左側(cè)床扶手以及責(zé)任護(hù)士的手指指腹分離到的。 8例CR-KP感染患者的臨床信息見表2。

表2 8例CR-KP感染患者臨床信息Table 2 Clinical data of 8 patients infected with carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in respiratory intensive care unit

2.2.2 肺炎克雷伯菌的耐藥譜及分子生物學(xué)特征 2018年5－7月RICU 8例住院患者分離獲得的12株CR-KP和3株與1號(hào)患者相關(guān)的環(huán)境中分離得的CR-KP共15株。對(duì)其進(jìn)行耐藥性及同源性分析，結(jié)果顯示15株CR-KP對(duì)3種碳青霉烯類、哌拉西林-他唑巴坦等β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、甲氧芐啶-磺胺甲唑、阿米卡星、磷霉素等抗菌藥物均呈高度耐藥；其中分離自患者的CR-KP各有1株對(duì)替加環(huán)素和頭孢他啶-阿維巴坦耐藥。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示15株CR-KP菌株均攜帶編碼KPC-2型碳青霉烯酶基因， MLST結(jié)果顯示15株CR-KP菌株均為ST11型。PFGE結(jié)果顯示15株CR-KP分別屬于A～H 8個(gè)不同的型別，聚類分析結(jié)果顯示菌株之間相似度低，僅2、3株菌可聚為一簇，提示菌株間的同源性較低，菌株的遺傳背景差異較大。見表 3。

表3 RICU 15株肺炎克雷伯菌的耐藥譜及分子生物學(xué)特征Table 3 Profiles of the 15 strains of Klebsiella pneumoniae isolated from respiratory intensive care unit

3 討論

近年來，CRE在世界范圍內(nèi)呈逐年增多趨勢(shì)，WHO將其列為最具威脅人類健康的“超級(jí)細(xì)菌”[8]，可使臨床抗感染治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，對(duì)全球公眾健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，形勢(shì)不容樂觀。

肺炎克雷伯菌是引起呼吸道感染最常見的病原菌之一，本研究發(fā)現(xiàn)ICU肺炎克雷伯菌檢出者存在呼吸系統(tǒng)感染癥狀的患者所占比例最高，因此規(guī)范化采集痰液標(biāo)本，提高痰標(biāo)本合格率尤為重要。2014－2018年我院ICU共檢出肺炎克雷伯菌1 580株，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率總體呈上升趨勢(shì)，亞胺培南、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦耐藥率分別從2014年的0.9%、1.1%、2.3%上升至2018年的17.1%、19.0%、17.8%。五年間CR-KP檢出率從2014年的3.6%上升至2018年的18.7%，2018年CR-KP的檢出率明顯高于前兩年。因此，動(dòng)態(tài)觀察肺炎克雷伯菌耐藥性及CR-KP的檢出率，有助于為醫(yī)院感控和臨床合理用藥提供依據(jù)。

本組資料顯示2018年5－7月短時(shí)間內(nèi)自RICU分離到的15株CR-KP的耐藥譜完全一致、均攜帶KPC-2型碳青霉烯酶耐藥基因、且均為ST11型，但PFGE聚類呈散在性分布。分析其中的1號(hào)患者在感染的不同時(shí)期和不同標(biāo)本中分離獲得的4株CR-KP 與該患者使用的呼吸機(jī)、床扶手以及參與護(hù)理的護(hù)士手指指腹分離的3株CR-KP菌株除PFGE顯示不聚類外其余特征均一致，并與其他同病區(qū)患者分離的CR-KP的特征亦一致。PFGE分析發(fā)現(xiàn)這些菌株無集中性的大簇聚類，僅2、3株菌可聚為一簇，提示菌株間的同源性較低，克隆呈散在分布。MLST顯示這些菌株均為ST11型，同國(guó)內(nèi)、國(guó)外大多報(bào)道相一致。值得注意的是，耐藥譜分析顯示出1株攜帶KPC-2、TEM、SHV、CTXM-8型耐藥基因的109號(hào)菌株對(duì)頭孢他啶-阿維巴坦耐藥，該菌碳青霉烯酶表型試驗(yàn)提示不攜帶金屬酶，是否攜帶其他耐藥基因需行進(jìn)一步研究。

我國(guó)既往報(bào)道過1種攜帶KPC-2的碳青霉烯類耐藥的高毒力ST11型肺炎克雷伯菌（HV-CRKP）克隆株[9]，以及ST11型碳青霉烯類耐藥高黏液型肺炎克雷伯菌（HKFK）的播散[10]。本研究結(jié)果顯示，1號(hào)患者住院環(huán)境中分離的3株CR-KP菌株與患者分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，除對(duì)替加環(huán)素、頭孢他啶-阿維巴坦敏感，對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南 、阿米卡星、哌拉西林-他唑巴坦、磷霉素等抗菌藥物高度耐藥；其耐藥基因型、ST分型相一致，PFGE分別為3個(gè)不同的型別?；仡櫛狙芯?號(hào)患者的臨床資料：68歲男性，初步診斷“肺部感染、呼吸衰竭、不完全性腸梗阻、腹膜炎”，入院后從痰液、腹水標(biāo)本中分別分離出CR-KP，后繼發(fā)血流感染，相繼從血液和膽汁中又分別分離出CR-KP。隨后隨機(jī)對(duì)其環(huán)境進(jìn)行多點(diǎn)采樣分析，在患者所使用的呼吸機(jī)表面、患者左側(cè)床扶手以及責(zé)任護(hù)士的手指指腹分離到CR-KP。本研究已無法判斷CR-KP的傳播模式，是已感染CR-KP患者在手術(shù)期間未能做好感控傳播至護(hù)理人員，亦或是護(hù)理人員在操作過程中未按感控要求操作感染患者。但本研究結(jié)果均提示做好消毒隔離及醫(yī)務(wù)人員的手衛(wèi)生工作可有效降低多重耐藥菌的醫(yī)院感染發(fā)生率，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致[11]。一項(xiàng)多中心前瞻性病例對(duì)照研究多因素分析顯示，入住ICU、腹部侵襲性手術(shù)、放療/化療、CR-KP除腸道外其他定植位點(diǎn)的數(shù)量是CR-KP腸道定植者發(fā)生CR-KP血流感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。腸道手術(shù)增加CRE腸道定植菌入血機(jī)會(huì)，造成血流感染，其預(yù)后差，病死率高[13-14]。早期識(shí)別，主動(dòng)篩查定植患者，能控制病原菌的傳播，降低病死率。

CR-KP的治療一直是臨床抗感染的難題，本組資料中1例腹腔感染患者最初經(jīng)驗(yàn)性使用亞胺培南1.0 g 1次/6 h 靜脈滴注，隨著病情發(fā)展聯(lián)合替加環(huán)素維持劑量50 mg 1次/12h，2例肺部感染患者莫西沙星治療效果不佳后聯(lián)合使用亞胺培南，并積極治療原發(fā)疾病和并發(fā)癥、把握呼吸機(jī)的撤離時(shí)機(jī)、給予合理的營(yíng)養(yǎng)支持后病情好轉(zhuǎn)。個(gè)別患者因現(xiàn)有資料有限，尚需進(jìn)一步調(diào)查研究。相關(guān)研究表明，多黏菌素、替加環(huán)素的體外抗菌活性較高，單一用藥效果往往不滿意，聯(lián)合碳青霉烯類等抗生素治療CRE感染可提高療效[15-18]，另外多黏菌素聯(lián)合碳青霉烯類治療也可減少質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥性[19]。頭孢地爾[20]、頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-vaborbactam[20]、頭孢吡肟-enmetazobactam和頭孢吡肟-taniborbactam[21]將作為治療CRE的新型藥物。

綜上所述，我院ICU中CR-KP耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物的管控、提高醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生的依從性、主動(dòng)篩查、盡早識(shí)別CRE攜帶者或感染者，避免耐藥菌的克隆傳播，從而遏制耐藥菌株在醫(yī)院傳播流行。