L型細(xì)菌與抗生素耐藥

劉 薔， 楊 萍， 盧 明， 陳代杰

L型細(xì)菌是一種細(xì)菌細(xì)胞壁形成受到抑制的特殊生長形式，可在體內(nèi)自發(fā)形成。本綜述主要闡述L型細(xì)菌與感染及其耐藥機(jī)制。

1 L型細(xì)菌與感染

L型細(xì)菌的基本形狀是球形的，但具有高度的可塑性，可在周圍環(huán)境的影響下呈現(xiàn)出一系列不規(guī)則的形狀。L型細(xì)菌在1935年由Klieneberger[1]在研究桿狀革蘭陰性菌莫尼鏈球菌時首次發(fā)現(xiàn)，并以其當(dāng)時工作的李斯特菌研究所（Lister Institute）命名[2]。

許多細(xì)菌都能形成L型，如枯草芽孢桿菌、博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）[3]等。自20世紀(jì)40年代起，L型細(xì)菌與一系列傳染病的聯(lián)系已有大量研究[4-6]，大多數(shù)研究主要集中于泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。不少文獻(xiàn)也報道了呼吸道、胃腸道、表皮和生殖系統(tǒng)感染。

人腎髓質(zhì)呈高滲生理環(huán)境[7]。此外，在泌尿系統(tǒng)細(xì)菌感染的患者中，尿液的滲透壓通常高于健康人[8]。因此，許多研究集中于L型細(xì)菌在復(fù)發(fā)性尿路感染（urinary tract infection， rUTI）中的重要性及導(dǎo)致疾病的可能性。

根據(jù)L型細(xì)菌可通過0.45 mm濾過器，而有壁細(xì)菌無法濾過的原理，研究者可從尿液或腎臟中分離出兩種L型細(xì)菌，將過濾后的樣品接種于有或無滲透保護(hù)的培養(yǎng)基中，并進(jìn)行長時間的培養(yǎng)。采用這種方法，20世紀(jì)60年代的研究者們從泌尿系統(tǒng)感染患者中成功分離出L型細(xì)菌[9-12]。

Domingue[4]綜述了20世紀(jì)60－80年代一系列的研究，這些研究通過顯微鏡方法對患有腎臟疾病和尿路感染患者的尿液和血液中的細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測。利用人類胚胎腎成纖維細(xì)胞（HEK）和感染大腸埃希菌、奇異變形桿菌或大腸埃希菌L型的無菌動物，研究L型細(xì)菌在宿主組織中的存活能力，提出宿主細(xì)胞中小的、電子密度高的、非泡狀的形式是細(xì)菌持留性的關(guān)鍵所在。Wittler等[13]在使用抗生素治療的亞急性心內(nèi)膜炎患者的血液中也檢測到小顆粒狀的形式。顆粒在滲透保護(hù)介質(zhì)中呈L型生長，隨后又回復(fù)到有壁桿菌。Almenoff等[14]從20例結(jié)節(jié)病患者中19例的血液標(biāo)本中分離出L型結(jié)核分枝桿菌，而健康對照組的血液中沒有生長。對慢性葡萄球菌感染、布魯菌病以及A群鏈球菌引起的風(fēng)濕熱患者進(jìn)行了相似的研究 [15- 19]。

20世紀(jì)早期的科學(xué)研究表明，引起rUTI的細(xì)菌可以通過采取細(xì)胞壁缺陷型或L型狀態(tài)幸存于細(xì)胞壁特異性抗生素的治療中。但由于缺乏分子診斷工具，這些研究難以令人信服[20]。而且，由于常規(guī)的微生物培養(yǎng)基是低滲的，并且不支持L型生長，因此L型細(xì)菌在臨床中幾乎被完全忽略。近期Mickiewicz等[21]發(fā)現(xiàn)在30例rUTI老年患者中29例的新鮮尿液中存在L型細(xì)菌。從rUTI患者中分離出的L 型細(xì)菌可以在有磷霉素的情況下在尿液中存活，并且在停用抗生素后能夠再生其細(xì)胞壁。同樣在斑馬魚幼蟲感染模型中也能發(fā)現(xiàn)同樣的轉(zhuǎn)換。Rojas等[22]發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性細(xì)菌外膜對細(xì)胞的機(jī)械穩(wěn)定性起了重要作用，這也許可以解釋為何L型細(xì)菌可在尿液中存活。

Beaman等[23-28]報道L型諾卡菌在疾病中可能的作用，發(fā)現(xiàn)在一個小鼠模型中的L型諾卡菌是從有壁細(xì)菌轉(zhuǎn)變而來。L型參與了持留性以及慢性肌瘤特征性顆粒的發(fā)展。有趣的是，L型細(xì)菌僅在免疫功能強(qiáng)的小鼠身上觀察到，而免疫系統(tǒng)不全（無脾無胸腺）的小鼠則不能檢測到，這表明體內(nèi)免疫系統(tǒng)對L型細(xì)菌有誘導(dǎo)作用。此外，他們成功地使用滲透保護(hù)型培養(yǎng)基從1例后來死于腦膿腫患者的腦脊液中分離出了多個L型細(xì)菌。且重要的是在無滲透保護(hù)的情況下培養(yǎng)時，并沒有觀察到任何細(xì)菌生長，提示L型是患者腦脊液中諾卡菌的主要或唯一的變異。其他研究也在尋找L型細(xì)菌與中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性感染之間的聯(lián)系，但結(jié)果并沒有定 論。

Zhang等[29]對62例合并糖尿病的結(jié)核病痰涂片陽性患者和89例非糖尿病結(jié)核病患者進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)在這62例研究對象中，46.77%結(jié)核分枝桿菌L（MTB-L）型呈陽性。糖尿病合并肺結(jié)核患者的耐藥性明顯高于單純肺結(jié)核患者，因此在確定結(jié)核病治愈的細(xì)菌學(xué)證據(jù)時，應(yīng)更嚴(yán)格地測試MTB-L型涂片染色檢查。

Akimoto等[30]在結(jié)節(jié)病患者Hamazaki-Wesenberg淋巴結(jié)中檢測到L型痤瘡丙酸桿菌。這可能是首次在結(jié)節(jié)病組織中證實(shí)的痤瘡丙酸桿菌L型感染病例報告，結(jié)節(jié)病組織發(fā)展為孤立性肉芽腫性厚腦膜炎。該研究提示，用PCR方法定量檢測血液或腦脊液中痤瘡丙酸桿菌的DNA有助于孤立性神經(jīng)瘤樣病變的診斷，而用抗生素二甲胺四環(huán)素和強(qiáng)力霉素治療是有效的。

L型細(xì)菌雖然與許多感染相關(guān)，但Schnell等[31]發(fā)現(xiàn)雖然未激活的巨噬細(xì)胞會使L型李斯特菌持留，但可以通過預(yù)激活干擾素（IFN）-γ或骨髓來源的巨噬細(xì)胞（BMM）有效地消除細(xì)菌。缺乏IFN-β觸發(fā)表明L型細(xì)菌無法從巨噬細(xì)胞逃逸到細(xì)胞質(zhì)中。這些結(jié)果表明由于毒力因子的表達(dá)減少和先天免疫識別，L型李斯特菌的致病性會大大減 弱。

2 L型細(xì)菌的耐藥機(jī)制

2.1 L型細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的改變與抗生素耐受

在體外，L型細(xì)菌形成困難，會因為產(chǎn)生活性氧（ROS）而致死。Kawai等[32]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)L型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與中心碳代謝相關(guān)。缺乏細(xì)胞壁或用β內(nèi)酰胺類抗生素阻止其合成，會導(dǎo)致糖酵解的通量增加，導(dǎo)致呼吸鏈中產(chǎn)生活性氧，阻止了L型細(xì)菌的生長。通過減慢糖酵解，激活糖異生或消耗氧氣來補(bǔ)償代謝失衡，可使L型枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌生長，而這些作用在缺乏呼吸鏈途徑的糞腸球菌中則不會發(fā)生。

L型細(xì)菌細(xì)胞壁的缺失會使其對細(xì)胞壁靶向藥物產(chǎn)生耐藥性。事實(shí)上，細(xì)胞壁靶向抗生素甚至促進(jìn)了有壁細(xì)胞向L型細(xì)菌的轉(zhuǎn)變[32]。例如，在滲透壓平衡的條件下，大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌中通?？梢苑乐功聝?nèi)酰胺類抗生素引發(fā)的災(zāi)難性鼓脹和細(xì)胞死亡，這些細(xì)菌傾向于失去其肽聚糖層，因此采用球形形態(tài)，即原生質(zhì)球形態(tài)[33-34]。原生質(zhì)球由于承受壓力的外膜而保持完整[22，35]。研究顯示，在包括銅綠假單胞菌、霍亂弧菌、陰溝腸桿菌和克雷伯菌在內(nèi)的一系列致病菌中都觀察到了這一現(xiàn)象[33-34]。用美羅培南（5 MIC）處理銅綠假單胞菌PA14菌株后，Monahan等[33]發(fā)現(xiàn)整個種群從正常桿狀細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槊黠@的球形細(xì)胞，在24 h內(nèi)整個種群僅由球形細(xì)胞組成。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（MH培養(yǎng)基）及與感染和體內(nèi)環(huán)境有關(guān)的條件（合成痰液和胎牛血清）下，均能觀察到此現(xiàn)象。用透射電鏡（TEM）觀察到球形細(xì)胞的細(xì)胞壁被破壞，表明當(dāng)用靶向細(xì)胞壁的抗生素攻擊時，銅綠假單胞菌可以轉(zhuǎn)化為L型，且此過程為可逆過程，去除抗生素壓力后，L型可轉(zhuǎn)變?yōu)樵瓉淼挠斜诩?xì)胞狀態(tài)。

Slavchev等[36]在體外通過低溫應(yīng)激處理產(chǎn)生MTB-L型。低溫脅迫處理后，使用Canetti絕對濃縮法對表型進(jìn)行評估，評估了親本菌株及其L型培養(yǎng)物對乙胺丁醇的敏感性，并通過PCR-RFLP分析針對embB306基因突變的分段。與對乙胺丁醇（2 mg/L）敏感的親本菌株相比，其L型表現(xiàn)出對高濃度乙胺丁醇（16 mg / L）的抗性。值得注意的是，在L型變異體中未發(fā)現(xiàn)embB306突變。此外，通過擴(kuò)增和測序16S rRNA基因片段，親本菌株和L型均無遺傳差異。在測試的特定位點(diǎn)，L型變異體缺乏遺傳變化，這促使它們通過展示非特異性防御機(jī)制和形成L型獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)來尋求其對乙胺丁醇的表型耐藥性的解釋。他們觀察到，在壓力下，結(jié)核分枝桿菌會發(fā)生劇烈的形態(tài)和功能變化，導(dǎo)致L型轉(zhuǎn)化。TEM和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)壁分離的碎片和無定形物質(zhì)圍繞著細(xì)胞呈膠囊狀物質(zhì)分布，使球形L體或球狀L型細(xì)胞的微菌落位于豐富的生物膜樣基質(zhì)中。Slavchev等[36]認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌對乙胺丁醇的耐藥表型可能與L型細(xì)菌細(xì)胞壁的改變或丟失有關(guān)，從而導(dǎo)致乙胺丁醇對其作用缺乏明確的靶點(diǎn)。L型細(xì)菌產(chǎn)生的膠囊狀結(jié)構(gòu)和生物膜基質(zhì)有助于其在抗菌藥物存在下的耐藥性和存活率。這兩種物質(zhì)會完全包圍L型細(xì)菌，起到屏障的作用來阻止抗生素的滲透。在無法殺死細(xì)胞壁缺陷L型細(xì)菌的情況下，抗結(jié)核治療無效。

2.2 L型細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的改變與免疫逃逸

最近的證據(jù)已經(jīng)明確證明革蘭陽性細(xì)菌可以在哺乳動物巨噬細(xì)胞內(nèi)的β內(nèi)酰胺類藥物治療中存活，它們通過轉(zhuǎn)化為L型來實(shí)現(xiàn)，L型是由宿主裂解酶（例如溶菌酶）的活性刺激的過程。這不僅在巨噬細(xì)胞中觀察到，而且能在動物模型中觀察到[32]。Kawai等[32]用枯草芽孢桿菌感染蠟螟（Galleria mellonella）的幼蟲（該模型具有先天免疫系統(tǒng)，其中包含與人類巨噬細(xì)胞類似的吞噬細(xì)胞，是一種使用越來越廣泛的簡單動物模型）時，能觀察到在血淋巴中懸浮著許多球形枯草芽孢桿菌細(xì)胞。他們認(rèn)為幼蟲吞噬細(xì)胞會影響細(xì)菌細(xì)胞狀態(tài)，這可能是由于幼蟲產(chǎn)生分解酶的作用而產(chǎn)生的。為了進(jìn)一步驗證猜想，他們將經(jīng)過細(xì)菌感染的血淋巴涂在含有青霉素G的等滲瓊脂上，對照組為血淋巴相同孵育條件下但無細(xì)菌感染。結(jié)果如預(yù)期，在孵育2 d后，對照組未出現(xiàn)菌落，而實(shí)驗組觀察到大量枯草芽孢桿菌的L型菌落，用金黃色葡萄球菌也獲得類似的結(jié)果?；谶@些結(jié)果，研究者認(rèn)為宿主環(huán)境中的免疫效應(yīng)物（可能包括溶菌酶）可以驅(qū)動L型轉(zhuǎn)變，從而有助于對β 內(nèi)酰胺類藥物耐受。

細(xì)胞壁缺陷細(xì)胞的可延展?fàn)顟B(tài)甚至可能通過有壁細(xì)胞難以通過的孔洞促進(jìn)菌體細(xì)胞在宿主內(nèi)的擴(kuò)散。由于它們?nèi)狈εc病原體相關(guān)的模式識別受體識別的各種分子，尤其是磷壁酸和肽聚糖[37-38]，因此先天免疫系統(tǒng)不易檢測到細(xì)胞壁缺陷形式。因此，細(xì)胞壁缺陷也可以使細(xì)菌在對壁靶向抗生素不敏感的狀態(tài)下逃脫先天免疫殺傷。至關(guān)重要的是，在抗生素治療終止后，這些細(xì)菌（特別是革蘭陰性細(xì)菌）可以有效地恢復(fù)到其有壁狀態(tài)，并重新導(dǎo)致宿主感染[20，39]。

3 小結(jié)

L型細(xì)菌是一種細(xì)菌細(xì)胞壁形成受到抑制的特殊的生長形式，可在體內(nèi)自發(fā)形成。見圖1。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)其在rUTI等感染中起著重要作用。由于細(xì)胞壁缺失以及隨之帶來的表面抗原減少，L型細(xì)菌可逃避壁靶向類抗生素以及巨噬細(xì)胞殺傷，產(chǎn)生抗生素耐受以及免疫逃逸現(xiàn)象，給臨床治療帶來不小的挑戰(zhàn)。將靶向細(xì)胞壁的抗生素與其他類別的抗生素（例如針對細(xì)菌膜的抗生素）組合使用可能是臨床治療細(xì)菌感染的新方向。

圖1 L型細(xì)菌感染及免疫逃逸與抗生素耐藥關(guān)系