薄荷醇提高臭氧治療大鼠角膜堿燒傷的實(shí)驗(yàn)研究

（.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 570；.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 5000）

臭氧也稱(chēng)超氧，是一種超活性氧，氧化性強(qiáng)、水溶性高，常溫下可以解離，具有供氧、殺菌等特點(diǎn)，目前應(yīng)用于諸多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如皮膚疾病或消毒、周?chē)?、腦梗死后遺癥等[1-2]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)臭氧還可用于治療眼部疾病，例如病毒性結(jié)膜炎和角膜疾病等眼部病變。研究[3]證實(shí)臭氧水溶液對(duì)兔眼煙曲霉菌性角膜潰瘍具有很好的抗菌治療效果，與氟康唑滴眼之間的比較，療效相似，而且具有天然不耐藥、成本低等優(yōu)勢(shì)。肖彩雯等[4]通過(guò)體外滅菌實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步證實(shí)了臭氧生理鹽水對(duì)真菌性角膜炎的治療效果。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，臭氧可以抑制大鼠堿燒傷后的氧化應(yīng)激反應(yīng)并改善預(yù)后，但由于臭氧水的不穩(wěn)定性，生物利用度不高，因此如何進(jìn)一步提高臭氧生物利用度，穩(wěn)定、加強(qiáng)其療效，對(duì)于臨床推廣和使用都具有重要意義，因此，如何提高臭氧的生物利用度，增強(qiáng)治療效果是本次研究需要解決的問(wèn)題。

薄荷醇屬于萜烯類(lèi)物質(zhì)，是唇形科植物薄荷和薄荷精油的主要有效成分。中醫(yī)記載，薄荷具有“芳香開(kāi)竅，引藥上行”滲透促進(jìn)劑的功能，被廣泛用于中藥外用制劑，與現(xiàn)代經(jīng)皮促透劑具有相似的作用。由于薄荷醇具有清涼鎮(zhèn)靜的作用，此外還可以使細(xì)胞表面的通透性增強(qiáng)，促使藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，減少藥物表面的滯留時(shí)間，因此薄荷醇作為促透劑輔助藥物吸收已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6]。薄荷醇除了可以外用，亦可作為清涼劑加入眼部制劑，緩解眼部刺激、干澀、灼熱等癥狀。Ahn等[7]研究顯示，含有薄荷醇的人工淚液明顯緩解干眼癥、促進(jìn)淚液的分泌，且作用溫和。本研究的主要目的是證實(shí)薄荷醇是否可以作為促透劑提高臭氧治療大鼠角膜堿燒傷的治療效果，進(jìn)而改良臭氧水眼部應(yīng)用制劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

SPF級(jí)健康雌性大鼠，體重250 ～ 300 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心動(dòng)物房供給。分為6組（n =6）：對(duì)照組（即正常組模型，不做任何處理，僅用于對(duì)照）、模型組、臭氧組（2 mg·L-1），0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組、0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組、0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組。大鼠堿燒傷模型制備：以4 mg·kg-1的劑量使用10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，進(jìn)行麻醉。剪切直徑為3.0 mm的圓形濾紙，在1 mol·L-1NaOH 溶液中浸泡60秒，并用其他濾紙將多余液體吸干后，迅速將其附著于角膜表面中央45秒，隨后快速使用生理鹽水于結(jié)膜囊沖洗70秒。在角膜中央可以看到灰白色的灼燒區(qū)域，呈圓形，大小相同表示建模成功。治療方案：堿燒傷模型組滴眼生理鹽水，每次3滴，每日3次，連續(xù)7 d。將臭氧溶解到滅菌注射用水中，制備成3 mg·L-1的濃度用于滴眼治療。 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.003 6 g，臭氧25.2 mL，蒸餾水加至5 mL），0.10%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.004 5 g，臭氧25.2 mL，蒸餾水加至5 mL，溶液呈無(wú)色透明狀，無(wú)刺激性等異味），0.12%薄荷醇臭氧滴眼液（甘油0.1 mL，薄荷醇0.005 3 g，臭氧25.2 mL，蒸餾水加至5 mL），滴注方式同上。治療第7天后，處死大鼠、取材一部分置于EP管中，并儲(chǔ)存于- 80℃冰箱中備用（ELISA法測(cè)SOD/MDA），另一部分用于HE染色和透射電鏡標(biāo)本制作。

1.2 形態(tài)學(xué)觀察

分別在堿燒傷后第1、3、7天對(duì)大鼠眼角膜進(jìn)行觀察。裂隙燈顯微鏡（SLM2型，重慶康華公司）觀察角膜溶解（使用Pfister評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）[8]，角膜渾濁（Holland評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）[9]。計(jì)算角膜新生血管長(zhǎng)度及面積，公式：S = C/12×3.141 6[r2（r - l）2]，C為角膜血管網(wǎng)所占的圓周數(shù)，l為新生血管的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，r為角膜半徑。

HE染色：取1 mm×2 mm角膜置10%中性甲醛中固定48 h，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色及照相（Olymspus CKX53，日本Olymspus公司）。

透射電鏡：取1 mm×2 mm角膜置于2.5%電鏡，用戊二醛溶液固定24 h，再經(jīng)鋨酸固定、脫水、置換、包埋、定位、LKB超薄切片，飽和醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，透鏡掃描照相（日立HT7800，日本日立公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)SOD、MDA數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，采用單因素方差分析的方法，P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 薄荷醇臭氧滴眼液對(duì)大鼠角膜堿燒傷后角膜恢復(fù)的影響

大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間角膜渾濁Holland評(píng)分詳見(jiàn)表1，其中0分最低（模型組），4分最高（對(duì)照組），評(píng)分越高顯示治療效果越好，實(shí)驗(yàn)評(píng)分顯示0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組效果最好。大鼠角膜燒傷后不同時(shí)間角膜溶解面積情況詳見(jiàn)表2，角膜燒傷后不同時(shí)間角膜血管新生面積情況詳見(jiàn)表3。治療7 d后，與所有模型組相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜溶解面積和角膜新生血管面積最低（P ＜ 0.05）。

2.2 薄荷醇臭氧滴眼液對(duì)大鼠角膜堿燒傷后氧化應(yīng)激損傷的抑制效果

角膜堿燒傷后，模型組與對(duì)照組相比MDA含量明顯增加，SOD活力明顯降低（P ＜ 0.05）。經(jīng)過(guò)薄荷醇臭氧滴眼液治療后明顯降低角膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)。與模型組相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液劑量組明顯降低角膜組織中MDA的表達(dá)（P ＜ 0.05），增加SOD的活性表達(dá)（P ＜ 0.05），詳見(jiàn)表4。

表1 各組大鼠角膜堿燒傷后不同時(shí)間角膜渾濁Holland評(píng)分Tab 1 Holland score of corneal opacity at different time after alkali burn in each group

表2 角膜燒傷后不同時(shí)間角膜溶解面積. ±s，mm2Tab 2 Corneal dissolution area at different time after corneal burn. ±s, mm2

表2 角膜燒傷后不同時(shí)間角膜溶解面積. ±s，mm2Tab 2 Corneal dissolution area at different time after corneal burn. ±s, mm2

注：與模型組比較，#P ＜ 0.05Note: compared with model group, #P ＜ 0.05

組別 傷后1 d 傷后3 d 傷后7 d對(duì)照組 0 0 0模型組 4.56±0.29 4.13±0.20 3.44±0.37臭氧組 4.44±0.32 3.48±0.42 3.15±0.52 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組4.42±0.17 3.12±0.66 2.79±0.31 0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組4.34±0.21 3.01±0.43# 2.45±0.24#0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組4.22±0.12 3.11±0.49 2.53±0.25#

表3 角膜燒傷后不同時(shí)間角膜血管新生面積.±s，mm2Tab 3 Corneal angiogenesis area at different time after corneal burn. ±s, mm2

表3 角膜燒傷后不同時(shí)間角膜血管新生面積.±s，mm2Tab 3 Corneal angiogenesis area at different time after corneal burn. ±s, mm2

注：與模型組比較，#P ＜ 0.05Note: compared with model group, #P ＜ 0.05

組別 傷后1 d 傷后3 d 傷后7 d對(duì)照組 0 0 0模型組 3.95±1.58 8.83±2.11 20.17±2.42臭氧組 3.66±0.74 8.59±1.45 18.05±2.32 0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組3.49±0.95 8.25±1.31 17.25±2.04 0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組3.36±1.23 8.24±1.54 16.77±3.94#0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組3.54±0.90 8.29±1.37 17.49±2.72

2.3 薄荷醇臭氧滴眼液對(duì)大鼠角膜堿燒傷后形態(tài)學(xué)的影響

表4 治療7 d后眼角膜組織中MDA和SOD含量Tab 4 MDA and SOD content in corneal tissue after 7 days of the treatment

HE結(jié)果顯示，在角膜燒傷后第7天，對(duì)照組大鼠角膜上皮細(xì)胞完整，基質(zhì)膠原纖維排列整齊，未見(jiàn)水腫；模型組角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)層結(jié)構(gòu)疏松，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，發(fā)生水腫；臭氧組角膜上皮細(xì)胞完整，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，水腫程度較輕；0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)層結(jié)構(gòu)疏松，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，發(fā)生水腫；0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)膠原纖維排列趨于整齊，水腫程度較陽(yáng)性對(duì)照組輕；0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細(xì)胞與基質(zhì)層疏松，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，水腫較模型組輕。

SEM角膜超微結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)，對(duì)照組角膜組織層次分明，上皮細(xì)胞間存在半橋粒，線粒體完好，基質(zhì)膠原纖維細(xì)胞排列整齊；模型組急性損傷后角膜上皮組織脫落，細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞核大，不規(guī)則，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂；0.08%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮層次不完整，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，線粒體變性明顯；0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮細(xì)胞層次略完整，細(xì)胞略微腫脹，細(xì)胞間有半橋粒連接，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完好；0.12%薄荷醇臭氧滴眼液組角膜上皮層次不完整，細(xì)胞腫脹，基質(zhì)膠原纖維排列紊亂，線粒體變性明顯。

3 討論

薄荷醇有很強(qiáng)的促滲透作用，是目前臨床領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的一種萜類(lèi)促透劑[10]。實(shí)驗(yàn)表明[11-12]薄荷醇可促透諸多藥物種類(lèi)，包括激素類(lèi)、抗菌類(lèi)藥物、抗炎類(lèi)藥物，抗癌、抗腫瘤類(lèi)藥物、麻醉藥物以及蛇床子素、丹參等中藥[13]。此外，由于薄荷醇自身具有消炎、驅(qū)風(fēng)、鎮(zhèn)痛、止癢的外用功效，在臨床上常用于清涼止癢、頭疼及鼻、咽、喉炎癥以及眼部制劑等。

薄荷醇的促透機(jī)制目前尚不明確，很多關(guān)于其機(jī)制的探討集中在Ca2+的濃度、細(xì)胞通透性、清涼、鎮(zhèn)靜等方面[14]。研究[15]證實(shí)薄荷醇可能通過(guò)TRPM8通道發(fā)揮清涼、鎮(zhèn)靜作用，因此可以減輕大鼠角膜堿燒傷后的灼熱效應(yīng)對(duì)細(xì)胞造成的損傷。另外，角膜堿燒傷主要的致病原理是熱灼傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)，新生血管的形成是影響視力恢復(fù)的重要環(huán)節(jié)因素[16]。在本課題組前期的實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)臭氧水制劑可以有效改善大鼠角膜堿燒傷后角膜溶解面積、降低新生血管面積、減低渾濁度（原理：臭氧可以釋放游離氧增加細(xì)胞氧供，促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)；另外，臭氧可以誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且抑制細(xì)菌的繁殖[17]），但由于臭氧不穩(wěn)定，常溫常壓下容易解離[18]，生物利用度差，為了改善提高臭氧進(jìn)入細(xì)胞的有效濃度和速度，采用藥物協(xié)同的方式，通過(guò)增加薄荷醇作為促透劑，打開(kāi)細(xì)胞膜表面的離子通道，使臭氧盡快進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其功效，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示堿燒傷后7 d，與臭氧組相比，0.10%薄荷醇臭氧滴眼液組確實(shí)可以減輕角膜新生血管面積、降低角膜渾濁度（P ＜ 0.05），并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。薄荷醇作為促透劑有其應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究的不足之處：本研究只是初步探索了薄荷醇作為促透劑的可能行，至于是否真正可以應(yīng)用于產(chǎn)品制劑中，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。另外，與冰片[19-20]等其它促透劑相比是否有優(yōu)勢(shì)，也還需要進(jìn)一步去證實(shí)。