氟喹諾酮類致藥物性肝損傷患者的免疫學(xué)及相關(guān)遺傳因素研究

（.中國人民解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京

100853；2 .重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016）

氟喹諾酮類藥物（fluoroquinolones，F(xiàn)QNs）具有高效、低毒、廣譜等優(yōu)點，臨床主要用于抗G+菌、G-菌、非典型致病菌和厭氧菌等治療呼吸道感染以及皮膚和軟組織感染，相關(guān)藥物性肝損傷也逐漸受到關(guān)注[1]。國內(nèi)外已有多個機構(gòu)發(fā)出警示，提示關(guān)注FQNs潛在的致肝損傷風(fēng)險[2-3]。藥物性肝損傷（druginduced liver injury，DILI）是指人體暴露于常規(guī)劑量或高劑量藥物后，因藥物本身或其代謝產(chǎn)物對肝臟的直接毒性，或人體對藥物或其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過敏或代謝特異質(zhì)反應(yīng)而導(dǎo)致的肝臟損傷，是肝生化異常與急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）的常見原因之一[4-6]。雖然DILI的發(fā)生機制尚未完全研究清楚，但免疫和遺傳因素在其發(fā)生和發(fā)展過程中一直被認為發(fā)揮著重要的作用[7-8]。本研究開展了實時主動監(jiān)測，采集FQNs用藥后發(fā)生DILI期間的患者及對照組血樣，研究免疫因素在FQNs致肝損傷中的作用機制，并篩選易感基因，以期通過基因篩查預(yù)防嚴(yán)重DILI發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 樣本來源及處理

設(shè)置藥品不良事件主動監(jiān)測與智能評估警示系統(tǒng)（ADE-ASAS）為實時監(jiān)測狀態(tài)，監(jiān)測目標(biāo)為2018年1月至2019年10月期間于我院住院且使用FQNs的所有患者。ADE-ASAS依照肝損傷監(jiān)測模塊中提前設(shè)置的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)[9]，發(fā)出FQNs相關(guān)肝損傷患者報警信號，再由兩名臨床藥師進行甄別，結(jié)合與臨床醫(yī)師的溝通結(jié)果作出最終陽性病例診斷，并納入病例組。同時，在使用了FQNs且未報警的人群中按照住院時間和病區(qū)匹配對照患者。在取得患者知情同意后分別用肝素鈉和EDTA-K2真空抗凝采血管取外周血全血5 mL用于后續(xù)檢測。本研究已獲得中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會審批并堅持遵循赫爾辛基宣言。

1.2 實驗室檢測

肝素鈉管中取全血1 ～ 2 mL及時進行流式細胞術(shù)實驗，剩余全血經(jīng)離心后取血漿凍存于- 80 ℃冰箱，用于細胞因子檢測。EDTA-K2管中全血分裝凍存于- 80 ℃冰箱，用于HLA基因分型。

1.2.1 免疫細胞 應(yīng)用8色流式方案檢測人外周血中的免疫細胞頻數(shù)分布，包括CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Th22和Treg細胞的含量。

1.2.2 細胞因子 使用Raybiotech抗體芯片試劑盒，利用多重夾心ELISA法的原理檢測人外周血中多種細胞因子表達水平，包括GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22、TNF-α。

1.2.3 HLA基因多態(tài)性 應(yīng)用Sanger法對患者的HLA基因進行高分辨率基因分型檢測，包括HLAⅠ類基因HLA-A、HLA-B、HLA-C，和HLAⅡ類基因HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，服從正態(tài)分布且方差齊的兩組均數(shù)比較采用t檢驗，兩組比較的非參數(shù)統(tǒng)計采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料描述采用頻數(shù)（百分比）表示，兩樣本率的比較采用χ2檢驗或Fisher's精確概率法。應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

實時監(jiān)測期間，ADE-ASAS共監(jiān)測到12 623例使用FQNs的住院患者，報警858例次。其中34例患者確定發(fā)生藥物性肝損傷。排除高齡（80歲以上）、病情嚴(yán)重、出院或拒絕抽血的患者，最終得到知情同意的DILI患者共10例，按照住院時間和病區(qū)匹配了20例使用FQNs后肝功能正常的對照患者。

2.1 免疫細胞

圖1 免疫細胞在藥物性肝損傷病例組和對照組外周血中的頻數(shù)分布Fig 1 The frequencies distribution of immune cells in peripheral blood of patients between DILI cases group and control group

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示（見圖1），在DILI病例組患者的外周血樣中，CD4+T細胞和Th22細胞頻數(shù)較對照組顯著升高。

2.2 細胞因子

為比較各免疫細胞的效應(yīng)分子在DILI患者和對照患者中的表達水平差異，運用ELISA法對多種細胞因子進行檢測。檢測結(jié)果如圖2所示，未發(fā)現(xiàn)病例組和對照組之間細胞因子表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 HLA基因多態(tài)性

HLA Ⅰ類等位基因和HLA Ⅱ類等位基因在病例組和對照組患者中的分布見表1和表2。研究結(jié)果顯示，病例組中DRB1*1501和DQB1*0602具有關(guān)聯(lián)性，但未發(fā)現(xiàn)不同HLA等位基因的分布差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

圖2 多種細胞因子在藥物性肝損傷病例組和對照組中的表達Fig 2 The expression of several kinds of cytokines in DILI cases group and control group

由于DILI的特殊性難以建立合適的動物模型，目前對其發(fā)病機制仍未有全面的認識。一般認為，DILI涉及多種機制和細胞通路，除了不同個體之間對藥物的代謝作用不同，免疫因素也被認為是導(dǎo)致DILI發(fā)生的重要組成部分。已有研究表示，宿主免疫參與了DILI的發(fā)病過程，并且患者發(fā)生肝損傷的易感性與HLA遺傳多態(tài)性相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在DILI患者的外周血中CD4+T細胞和Th22細胞頻數(shù)較對照組顯著升高，提示是CD4+T細胞而非CD8+T細胞參與了FQNs引起的肝損傷，而其中的Th22細胞在FQN致肝損傷炎癥及免疫病理損傷中可能發(fā)揮著重要作用。賴榮陶[11]也曾發(fā)現(xiàn)在DILI發(fā)生之初，Th22細胞與ALT水平明顯正相關(guān)，并且肝內(nèi)IL-22與肝損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示通過檢測Th22細胞頻數(shù)及IL-22的表達來判斷FQN致肝損傷患者預(yù)后的潛在可能性。

在細胞因子檢測結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)病例組和對照組之間細胞因子表達水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但結(jié)果顯示Th22細胞表達的效應(yīng)分子IL-13、IL-22和TNF-α在病例組患者中較對照組患者有所升高，與流式細胞術(shù)結(jié)果病例組中Th22細胞頻數(shù)較高具有一致性。在2011年，Zhang等[12]將IL-22注射到乙肝病毒（HBV）轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)促炎基因明顯上調(diào)。另有一項關(guān)于慢性丙型肝炎（HCV）的研究顯示，肝臟IL-22 mRNA表達在HCV及自身免疫性肝炎中明顯升高，認為肝內(nèi)IL-22水平與病毒性肝炎的肝臟炎癥壞死程度可能相關(guān)，并推測IL-22可能發(fā)揮促炎及肝損傷作用[13]。但在四氯化碳、刀豆球蛋白、Fas配體誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠中發(fā)現(xiàn)IL-22蛋白可能保護肝臟抵抗炎癥、壞死及凋亡[14-16]。因此，IL-22在不同肝臟疾病模型中的作用尚存爭議，提示對于Th22細胞及其效應(yīng)分子在FQNs致肝損傷疾病進程中的作用仍值得進一步研究。

表1 HLA Ⅰ類等位基因在病例組和對照組中的分布Tab 1 The frequencies of HLA classⅠalleles in cases group and control group

表2 HLA Ⅱ類等位基因在病例組和對照組中的分布Tab 2 The frequencies of HLA classⅡalleles in cases group and control group

此外，有研究認為藥物或其代謝產(chǎn)物可作為半抗原與內(nèi)源性蛋白結(jié)合，并隨后形成新抗原，當(dāng)其與特定的HLA分子結(jié)合時，可能引起不適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)從而導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生[17]。已發(fā)現(xiàn)有多個人類HLA等位基因與特定藥物導(dǎo)致的DILI風(fēng)險增加存在關(guān)聯(lián)性，例如HLA-DRB1*15:01-DQB1*06:02與阿莫西林克拉維酸和羅美昔布致肝損傷相關(guān)，HLADRB1*07:01攜帶者使用希美加群發(fā)生肝損傷風(fēng)險更高[18-22]。在本研究的HLA基因分型結(jié)果中未發(fā)現(xiàn)分布差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義的相關(guān)基因。雖然本研究的患者組中DRB1*1501和DQB1*0602具有關(guān)聯(lián)性（即攜帶DQB1*0602的患者也同時攜帶DRB1*1501），但單倍型DRB1*1501-DQB1*0602在兩組間的分布頻率亦未見統(tǒng)計學(xué)差異，因此仍需要在更大的樣本人群中對該可疑基因進行驗證。

本研究基于ADE-ASAS與HIS對接實施實時監(jiān)測，能夠快捷鎖定目標(biāo)人群并及時獲取樣本，用藥者分散在不同病區(qū)時尤具優(yōu)勢。最終收集的患者樣本量較少，是由于研究過程中因FQNs安全性廣受關(guān)注，各級監(jiān)管政策均在收緊，導(dǎo)致初始監(jiān)測的目標(biāo)藥物莫西沙星使用量顯著減少，后期增納了左氧氟沙星和環(huán)丙沙星，報警規(guī)則由iSAEC標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整為國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)[9]，但效果有限。