a-1, 2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶II在肺鱗癌組織中的表達及對肺鱗癌細胞增殖的影響

王維杰，范賽榮，張光輝，孫海婷，施國富，馬璇，朱成楚

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬象山醫(yī)院 胸外科，浙江 寧波 315700；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺州醫(yī)院 胸外科，浙江 臺州 317000）

肺鱗狀細胞癌是一種常見的非小細胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）亞型，每年全球約有30多萬人受累[1]。目前，對于肺鱗癌的治療，以外科手術(shù)切除為主，對于不能手術(shù)的疾病只能采取細胞毒性化療和免疫治療[2]。然而，由于目前缺乏較為特異的早期診斷標志物，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已處于臨床晚期[3]，而錯過了最佳治療期。因此，尋找肺鱗癌特異的早期診斷標志物，顯得尤為重要。據(jù)報道，a-1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶II（a-1，2 fucosyltransferase II，F(xiàn)UT2）可以通過a-1，2糖苷鍵將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到N-乙酰氨基的末端半乳糖上，其在多種腫瘤中均呈現(xiàn)高表達，是腫瘤發(fā)生的早期標志物之一[4-5]。然而，關(guān)于FUT2在肺鱗癌患者中的差異表達及其對肺鱗癌細胞增殖的影響目前尚未見報道。因此，本研究主要通過生物信息數(shù)據(jù)分析和FUT2低表達細胞模型來探究FUT2在肺鱗癌中的表達情況，及其對肺鱗癌細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與質(zhì)粒載體：肺鱗癌細胞H226購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細胞庫。FUT2的低表達質(zhì)粒載體psi-U6.1/eGFP/Puro-FUT2（shFUT2）及其對照載體psi-U6.1/eGFP/Puro-NC由美國GeneCopoeia公司設(shè)計構(gòu)建并經(jīng)測序驗證。

1.1.2 試劑：胎牛血清購自美國Hyclone公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，細胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，青霉素-鏈霉素溶液（×100）、胰酶細胞消化液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、β-actin小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG及鼠IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，CCK-8試劑購自日本Dojindo同仁化學(xué)研究所，F(xiàn)UT2、Bcl-2、Bax兔單克隆抗體購自美國Abcam公司，PCNA兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 差異性分析：UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）是根據(jù)TCGA臨床患者數(shù)據(jù)，對原發(fā)腫瘤樣本進行分類，并繪制不同亞組各基因表達水平的數(shù)據(jù)圖，包括臨床分期、性別、年齡、組別[6]。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫分析FUT2在肺鱗癌組織和正常癌旁組織中的表達差異，及FUT2與肺鱗癌患者的臨床分期、性別、年齡的相關(guān)性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：用含1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清及89% RPMI 1640培養(yǎng)基的體系，在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H226肺鱗癌細胞株。實驗分組為：NC組（空載體對照組）及shFUT2組（FUT2低表達組）。

1.2.3 細胞瞬時轉(zhuǎn)染：提前于6孔板鋪適量H226細胞懸液，待其生長密度達到75%時，進行細胞轉(zhuǎn)染操作，將RPMI 1640培養(yǎng)基與LIPO 2000按照每孔125 μL:5 μL的比例配制轉(zhuǎn)染A液，將RPMI 1640培養(yǎng)基與相應(yīng)質(zhì)粒DNA按照每孔125 μL:2500 ng的比例配制轉(zhuǎn)染B液，將A、B液混合室溫孵育15 min后以250 μL/孔逐滴加入待轉(zhuǎn)染細胞孔中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.4 CCK-8實驗：將對數(shù)期細胞調(diào)整成8×105個/mL，接種于96孔板進行正常培養(yǎng)，分別于24 h、48 h及72 h在實驗孔以10 μL/孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，上機檢測450 nm處各孔吸光度。

1.2.5 平板克隆實驗：細胞以300個/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆團后，用900 μL 4%多聚甲醛固定細胞30 min，結(jié)晶紫染20 min，洗去染色液，拍照記錄實驗結(jié)果。

1.2.6 Western blot法：應(yīng)用BCA試劑檢測提取的H226細胞總蛋白濃度，并用5×Loading Buffer及細胞裂解液將樣本蛋白濃度均調(diào)整為1 μg/μL，隨后于金屬加熱儀100 ℃加熱10 min變性得到實驗所需樣本，隨后配至Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠和濃縮膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂牛奶封閉、TBST洗滌、4 ℃一抗孵育過夜、TBST洗滌、孵育相應(yīng)二抗1 h、TBST洗滌、ECL化學(xué)發(fā)光檢測，最后采用Image Lab圖像分析軟件進行各組蛋白表達的灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUT2在肺鱗癌組織中的表達 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：與癌旁正常組織（Normal）組相比，F(xiàn)UT2基因在肺鱗癌組織（Primary tumor）中呈現(xiàn)明顯高表達趨勢，且主要集中表達在stage1、stage2、stage3期（P＜0.05），而stage4與Normal組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在引入年齡因素的情況下，與Normal組相比，F(xiàn)UT2在肺鱗癌患者的41～100歲年齡段中呈現(xiàn)高表達趨勢，但是各年齡組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，不同性別肺鱗癌患者之間FUT2表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 FUT2低表達細胞模型的鑒定 為進一步在細胞水平驗證FUT2對肺鱗癌的影響，我們通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建敲減FUT2的H226細胞模型，通過Western blot實驗驗證其低表達效果，結(jié)果顯示，與NC組相比，shFUT2組的FUT2蛋白表達水平明顯降低（3.26±0.16vs.1.87±0.28），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），可以應(yīng)用于后續(xù)實驗。

圖1 應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析FUT2在肺鱗癌患者中的差異性表達

2.3 FUT2低表達可以抑制H226細胞的增殖 采用CCK-8實驗連續(xù)監(jiān)測3 d的細胞生長速率，結(jié)果顯示，與NC組比，shFUT2組的細胞增殖率在48 h和72 h均受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在平板克隆形成實驗及Western blot實驗中，敲減FUT2的表達后，單克隆細胞團的形成數(shù)及細胞增殖因子PCNA蛋白的表達（1.39±0.07vs.1.05±0.17）均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 FUT2對肺鱗癌細胞增殖的影響

2.4 FUT2對H226細胞凋亡相關(guān)因子的影響 與NC組相比，F(xiàn)UT2低表達后，細胞凋亡負調(diào)因子Bcl-2蛋白表達水平受到明顯抑制（2.10±0.04vs.1.20±0.26，P＜0.01），同時，又促進了凋亡正調(diào)因子Bax蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.89±0.30vs.1.65±0.51，P＜0.05）。

3 討論

巖藻糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型，被認為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的普遍標志[3，7-8]。在腫瘤細胞中常常表現(xiàn)出巖藻糖基化的增加，這一改變，極大地影響了腫瘤細胞與細胞的黏附、細胞與基質(zhì)的相互作用、細胞信號傳遞、代謝、血管生成和免疫調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[7，9]。巖藻糖基化修飾異常的基礎(chǔ)是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的異常改變，而FUT2是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一。近年來，對腫瘤細胞的巖藻糖基化修飾的研究越來越多。有研究報道，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可以促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，其基因亦可能作為循環(huán)標志物被應(yīng)用于肺癌的早期檢測診斷[10-11]。但是，關(guān)于FUT2對肺鱗癌影響的研究目前尚未見報道。

本研究借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)和FUT2低表達細胞模型，探究了FUT2在肺鱗癌患者中的差異表達及其對肺鱗癌細胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明FUT2在肺鱗癌患者中呈現(xiàn)明顯的高表達趨勢，并且主要在肺鱗癌TNM分期的Stage1、Stage2和Stage3高表達，而其與年齡和性別無關(guān)。此外，平板克隆實驗、CCK-8實驗及對經(jīng)典的增殖因子PCNA蛋白表達水平的檢測，均證明了敲減FUT2的表達后，明顯抑制了H226細胞株的增殖能力。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其主要功能是抑制細胞凋亡，并通過阻滯細胞周期的G0/G1期來延長細胞的存活[12-13]。當Bcl-2與凋亡正調(diào)因子Bax的表達水平失衡，會引起線粒體功能發(fā)生紊亂，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減FUT2能明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，相反地，促進了促凋亡蛋白Bax的表達水平，說明低表達FUT2可以促進肺鱗癌細胞的凋亡能力，但仍需要繼續(xù)進行明確及驗證。

綜上所述，F(xiàn)UT2在肺鱗癌患者中顯著高表達，并且經(jīng)過進一步對臨床分期的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：FUT2與肺鱗癌TNM分期的Stage1、Stage2和Stage3期均有關(guān)聯(lián)，而其與TNM分期的Stage4期及患者年齡、性別并無明顯關(guān)聯(lián)。由此表明FUT2可能影響著肺鱗癌疾病的發(fā)生發(fā)展，且主要發(fā)生在其早中期。細胞水平實驗結(jié)果表明，F(xiàn)UT2可能通過上調(diào)增殖因子PCNA蛋白的表達從而促進肺鱗癌細胞的增殖，同時，可以抑制肺鱗癌細胞的凋亡能力進而促進肺鱗癌細胞的生長。但具體影響和機制如何，有待于后續(xù)進一步更深層次地探究和論證。