• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-19a對(duì)腹主動(dòng)脈瘤血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移及炎癥浸潤(rùn)的影響

    2020-07-24 11:54:50歐陽(yáng)勇劉彥葉洋波
    關(guān)鍵詞:主動(dòng)脈靶向試劑盒

    歐陽(yáng)勇,劉彥,葉洋波

    (杭州市富陽(yáng)區(qū)第一人民醫(yī)院 血管外科,浙江 杭州 311400)

    腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是常見(jiàn)的慢性主動(dòng)脈退行性疾病,具有高發(fā)病率和高病死率,嚴(yán)重危害中老年人生命健康。臨床研究發(fā)現(xiàn),主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)異常增殖、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和基質(zhì)降解與AAA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。但是,有關(guān)AAA發(fā)展過(guò)程中的炎癥浸潤(rùn)和VSMCs增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)在AAA組織中異常表達(dá),且與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。已有研究表明,過(guò)表達(dá)miRlet-7a可下調(diào)炎癥反應(yīng)[4],過(guò)表達(dá)miR-21可抑制VSMCs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)AAA的發(fā)展[5]。此外,LIU等[6]研究發(fā)現(xiàn),miR-19a在AAA組織中高表達(dá),但其在AAA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-19a在AAA患者AAA組織和血清中的表達(dá)水平,探討miR-19a對(duì)主動(dòng)脈VSMCs生物學(xué)行為以及炎癥浸潤(rùn)的影響和作用機(jī)制,以期為AAA臨床治療提供潛在靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 收集臨床樣本:組織標(biāo)本為2015年3月至2017年6月于杭州市富陽(yáng)區(qū)第一人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的15例AAA患者的腹主動(dòng)脈組織和器官移植中心行肝臟、腎臟器官移植術(shù)(供體排除AAA以及其他腹主動(dòng)脈相關(guān)病變)15例患者殘留的部分正常腹主動(dòng)脈組織。血清樣本來(lái)源于15例AAA患者和同期進(jìn)行體檢的15例健康者。手術(shù)前均告知患者并簽署知情同意書(shū),并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.1.2 細(xì)胞和主要試劑:人主動(dòng)脈VSMCs(BNCC340185)和人單核巨噬細(xì)胞THP-1(BNCC100407)均購(gòu)自廣州北納生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12和α-MEM、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;miR-19a inhibitor/mimic,pcDNA3.1-CDKN2B質(zhì)粒以及陰性對(duì)照均由上海吉馬公司合成;TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;LipofectamineTM3000和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司;ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司;兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)、β-actin單克隆抗體和HRP山羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;青霉素、鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

    1.2 方法

    1.2.1 巨噬細(xì)胞分離和培養(yǎng):采用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基從AAA患者和健康體檢者外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞。采用PBS緩沖液按照1:1的比例稀釋肝素化的血清,2000 r/min離心20 min,收集乳白上清液,再加入4 mL細(xì)胞洗滌液于2000 r/min離心20 min即可得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。隨后,將分離得到的外周血單核細(xì)胞懸液置于含有10%的胎牛血清、雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)、25 ng/mL單核細(xì)胞集落刺激因子的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:采用含有10%的胎牛血清和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)VSMCs和采用RPMI-1640培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí),以2×105個(gè)/孔的濃度接種到6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪板24 h內(nèi),培養(yǎng)至細(xì)胞單層密度達(dá)到50%~60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將VSMCs或THP-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor、miR-19a mimic和pcDNA3.1-CDKN2B。轉(zhuǎn)染后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h,更換雙倍血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-19a的表達(dá)水平:收集組織、血清樣本和處理后的細(xì)胞,采用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA,并采用NanoDrop檢測(cè)RNA的濃度。隨后,采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,嚴(yán)格按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-19a表達(dá)水平,以U6為內(nèi)參。miR-19a上游引物為5’-CTGGAGTGTGCAAATCTA TGC-3’,下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’,下游引物為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平:收集處于對(duì)數(shù)期的VSMCs和THP-1細(xì)胞,采用RAPI裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白,檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行10% SDS-PAGE分離蛋白、電轉(zhuǎn)膜法將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別加入CDKN2B(1:1000)和β-actin抗體(1:1000),4 ℃孵育過(guò)夜。之后,加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1:2000)室溫孵育2 h。最后,進(jìn)行ECL染色,凝膠成像儀采集圖像;通過(guò)ImageJ分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.5 CCK-8檢測(cè)VSMCs細(xì)胞增殖活力:將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以2×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中,并在每孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基(含有50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清),每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后,向每孔中加入10 μL CCK-8溶液(0.5 mg/mL)后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h后,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的每孔光密度(OD450)值。

    1.2.6 Transwell檢測(cè)VSMCs細(xì)胞遷移能力:將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以1×105個(gè)/孔的濃度接種于Transwell小室上室,下室加入500 μL混合培養(yǎng)基(250 μL巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和250 μL DMEM/F12培養(yǎng)基)后常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,并于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)算侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMCs凋亡情況:取各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96孔板中,過(guò)夜培養(yǎng)后用胰蛋白酶消化細(xì)胞,PBS洗滌后加入300 μL結(jié)合液重懸,加入10 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min,再加入5 μL PI溶液染色,混合均勻后避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比。

    1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-19a和CDKN2B的靶向關(guān)系:由湖南普拉特澤生物科技有限公司構(gòu)建CDKN2B基因的3’UTR,插入pGL3-Promoter質(zhì)粒載體中,將該重組質(zhì)粒命名為pGL3-CDKN2B-3’UTR WT,采用基因突變法定點(diǎn)突變獲得CDKN2B突變型載體(pGL3-CDKN2B-3’UTR MUT)。然后,將HEK 293T細(xì)胞接種于12孔板中,待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%~70%時(shí)分別將miR-19a mimic和mimic-NC,CDKN2B野生型載體、CDKN2B突變型載體共轉(zhuǎn)染于HEK 293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6 h后更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)36 h。最后,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.9 ELISA檢測(cè)炎性因子的表達(dá)水平:將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液RPMI-1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)結(jié)束后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,2組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-19a在AAA組織和血清中高表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-19a在AAA組織中的表達(dá)水平明顯高于正常腹主動(dòng)脈組織(P<0.01)。與健康組比,miR-19a在AAA患者血清中的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

    圖1 miR-19a在AAA患者組織(A)和血清(B)中的表達(dá)

    2.2 敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,敲降miR-19a可明顯下調(diào)miR-19a在VSMCs中的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖2A;CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,敲降miR-19a后VSMCs增殖活力明顯低于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖2B;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,敲降miR-19a可顯著誘導(dǎo)VSMCs凋亡水平(P<0.01),見(jiàn)圖2C;Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs遷移能力(P<0.01),見(jiàn)圖2D。

    2.3 敲降miR-19a抑制THP-1細(xì)胞炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的表達(dá) ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖3A-C。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,敲降miR-19a可明顯抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖3D。由此可知,敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子和THP-1細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)水平。

    圖2 敲降miR-19a對(duì)VSMCs增殖、凋亡和遷移(×100)的影響

    2.4 miR-19a靶向負(fù)調(diào)CDKN2B的表達(dá) 通過(guò)比對(duì)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),CDKN2B是miR-19a的潛在靶基因,其結(jié)合位點(diǎn)如圖4A所示。同時(shí),雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明,相比于對(duì)照組(mimic-NC),過(guò)表達(dá)miR-19a可顯著減少野生型CDKN2B質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01),但對(duì)突變型CDKN2B質(zhì)粒熒光素酶的活性沒(méi)有影響,見(jiàn)圖4B。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-19a可顯著下調(diào)VSMCs中CDKN2B蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖4C。

    2.5 miR-19a靶向CDKN2B抑制VSMCs增殖、侵襲和誘導(dǎo)凋亡 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著上調(diào)VSMCs中CDKN2B蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),但同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-19a和CDKN2B后VSMCs中CDKN2B的表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖5A。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著抑制VSMCs增殖活力(P<0.01),見(jiàn)圖5B。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著誘導(dǎo)VSMCs凋亡水平(P<0.01),見(jiàn)圖5C。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CDKN2B后VSMCs遷移能力明顯低于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖5D。但同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-19a和CDKN2B后可明顯緩解僅過(guò)表達(dá)CDKN2B對(duì)VSMCs增殖、凋亡和遷移的調(diào)控作用(P<0.01),見(jiàn)圖5B-D。

    圖3 敲降miR-19a對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥因子和MMP表達(dá)的影響

    2.6 miR-19a靶向CDKN2B下調(diào)THP-1細(xì)胞炎癥因子和MMPs的表達(dá)水平 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著下調(diào)TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平(P<0.01),但同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-19a和CDKN2B可緩解僅過(guò)表達(dá)CDKN2B對(duì)炎癥因子的抑制作用(P<0.01),見(jiàn)圖6。Western blot檢測(cè)證實(shí),相比于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著抑制MCP-1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平(P<0.01);但同時(shí)過(guò)表達(dá)CDKN2B和miR-19a后MCP-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5A。

    3 討論

    AAA是一種嚴(yán)重的遲發(fā)性血管疾病,病死率高。近年來(lái),miRNA被廣泛報(bào)道通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為,進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。LI等[7]研究表明,miR-19a可作為心臟、血管和神經(jīng)元相關(guān)疾病的早期診斷和治療靶點(diǎn)。MENG等[8]研究發(fā)現(xiàn),miR-183和miR-141與AAA的不良預(yù)后密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)miR-155-3p通過(guò)促進(jìn)VSMCs的增殖和抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)AAA的發(fā)生與發(fā)展[9]。PENG等[10]研究表明,過(guò)表達(dá)miR-26a通過(guò)靶向PTEN促進(jìn)VSMCs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而誘導(dǎo)AAA的發(fā)展。同時(shí),前期研究也證實(shí),異常表達(dá)的miR-19a與炎癥和腫瘤密切相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,miR-19a在AAA主動(dòng)脈壁組織和血清中高表達(dá);敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖和遷移能力,以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí),敲降miR-19a抑制了THP-1細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)。機(jī)制上,miR-19a通過(guò)靶向下調(diào)CDKN2B的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)VSMCs增殖和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá),從而加速AAA的發(fā)展進(jìn)程。

    圖5 miR-19a靶向CDKN2B對(duì)VSMCs增殖、凋亡和細(xì)胞遷移(×100)的影響

    圖6 miR-19a靶向CDKN2B對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響

    巨噬細(xì)胞是炎癥和免疫學(xué)的關(guān)鍵細(xì)胞之一,miR-19a在多種炎癥遞質(zhì)作用下表達(dá)增強(qiáng)[13-14]。巨噬細(xì)胞的存在可損傷動(dòng)脈壁,因?yàn)榫奘杉?xì)胞產(chǎn)生的MMPs可以降解血管管壁中層彈力纖維,造成血管壁順應(yīng)性降低,并在血流的沖擊作用下加劇瘤體擴(kuò)張,使膠原蛋白產(chǎn)生崩解[15]。例如,敲降miR-33-5p可通過(guò)緩解THP-1炎癥因子的表達(dá)和MMPs的表達(dá),進(jìn)而緩解AAA的發(fā)展進(jìn)程[16]。同時(shí),ZHANG等[17]研究結(jié)果證實(shí),敲降miR-155通過(guò)抑制THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá),進(jìn)而緩解血管緊張素II誘導(dǎo)小鼠AAA形成。miR-195通過(guò)抑制炎性因子和MMPs的表達(dá),緩解了AAA的發(fā)展進(jìn)程[18]。與前期研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)miR-19a水平在AAA患者組織和血清中高表達(dá)。同時(shí),敲降miR-19a抑制了THP-1細(xì)胞上清液中炎癥因子的表達(dá)水平以及主動(dòng)脈彈性蛋白的表達(dá)。此外,過(guò)表達(dá)miR-19a促進(jìn)了VSMCs的遷移。以上研究結(jié)果提示,抑制炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá)可預(yù)防AAA動(dòng)脈壁破裂的發(fā)生。

    CDKN2B作為多種惡性腫瘤的抑癌基因,通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞增殖、周期和凋亡進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[19-20]。在血管系統(tǒng)中,CDKN2B通過(guò)介導(dǎo)p53參與血管重塑[21]。LEEPER等[22]研究表明,敲降CDKN2B通過(guò)上調(diào)p53的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈瘤的形成。GAO等[23]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-15a通過(guò)靶向抑制CDKN2B上調(diào)平滑肌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)AAA的發(fā)展進(jìn)程。同時(shí),本研究結(jié)果同樣證實(shí),敲降miR-19a通過(guò)靶向上調(diào)CDKN2B抑制平滑肌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以及緩解THP-1細(xì)胞上清炎癥因子和MMPs的表達(dá),進(jìn)而緩解AAA的發(fā)展進(jìn)程。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)資料我們推斷,miR-19a/CDKN2B分子軸在AAA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,并且調(diào)控VSMCs增殖、凋亡和細(xì)胞遷移以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但其能否作為新的治療靶點(diǎn)投入到臨床中還需要進(jìn)一步深入研究。

    猜你喜歡
    主動(dòng)脈靶向試劑盒
    如何判斷靶向治療耐藥
    MUC1靶向性載紫杉醇超聲造影劑的制備及體外靶向?qū)嶒?yàn)
    毛必靜:靶向治療,你了解多少?
    肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:18
    Stanford A型主動(dòng)脈夾層手術(shù)中主動(dòng)脈假腔插管的應(yīng)用
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
    靶向超聲造影劑在冠心病中的應(yīng)用
    護(hù)理干預(yù)預(yù)防主動(dòng)脈夾層介入治療術(shù)后并發(fā)癥
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    胸腹主動(dòng)脈置換術(shù)后感染并發(fā)癥救治一例
    中文字幕高清在线视频| av黄色大香蕉| 日韩欧美精品免费久久 | 不卡一级毛片| 手机成人av网站| netflix在线观看网站| 成人精品一区二区免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 狂野欧美激情性xxxx| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 好男人在线观看高清免费视频| 一区二区三区免费毛片| 变态另类丝袜制服| 国产成人福利小说| 国产精品三级大全| 九九热线精品视视频播放| 欧美一区二区国产精品久久精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜福利免费观看在线| 国产黄色小视频在线观看| av在线天堂中文字幕| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久99热这里只有精品18| 久久精品人妻少妇| h日本视频在线播放| 国产午夜精品论理片| 亚洲国产欧美网| 少妇的逼水好多| 18+在线观看网站| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲在线观看片| 九色国产91popny在线| 两个人看的免费小视频| 国产成人av激情在线播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费在线观看日本一区| 少妇的逼水好多| 日本熟妇午夜| 网址你懂的国产日韩在线| 国产视频一区二区在线看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精品在线美女| 欧美区成人在线视频| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 我的老师免费观看完整版| 亚洲 国产 在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美bdsm另类| 丰满的人妻完整版| 久久精品影院6| 久久6这里有精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲熟妇熟女久久| 宅男免费午夜| 国产欧美日韩精品亚洲av| 19禁男女啪啪无遮挡网站| www.999成人在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 久久精品综合一区二区三区| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 欧美一区二区亚洲| 深爱激情五月婷婷| 成人午夜高清在线视频| 欧美日韩乱码在线| 日韩欧美免费精品| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲在线自拍视频| 亚洲av成人精品一区久久| 成人精品一区二区免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 一个人看视频在线观看www免费 | 国产av不卡久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲av成人av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品国产三级普通话版| 88av欧美| 色综合站精品国产| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲av电影在线进入| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 偷拍熟女少妇极品色| 91在线精品国自产拍蜜月 | 午夜日韩欧美国产| 757午夜福利合集在线观看| 国产乱人伦免费视频| 成年女人看的毛片在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 中文字幕av成人在线电影| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产免费av片在线观看野外av| 丰满的人妻完整版| 哪里可以看免费的av片| 天堂动漫精品| 久久久久久大精品| 欧美性感艳星| 免费人成视频x8x8入口观看| 日本一二三区视频观看| 操出白浆在线播放| 国产日本99.免费观看| 免费看日本二区| 色av中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 三级毛片av免费| 男人和女人高潮做爰伦理| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产爱豆传媒在线观看| 久久人人精品亚洲av| 国产一区二区在线观看日韩 | 一区二区三区免费毛片| 亚洲av免费高清在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3| 一区二区三区国产精品乱码| 免费看光身美女| 国产高清视频在线播放一区| 色噜噜av男人的天堂激情| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美zozozo另类| 亚洲国产色片| 狂野欧美激情性xxxx| 国产激情欧美一区二区| 日韩精品中文字幕看吧| av在线蜜桃| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日本免费a在线| 亚洲最大成人手机在线| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲国产精品久久男人天堂| 9191精品国产免费久久| 激情在线观看视频在线高清| 又粗又爽又猛毛片免费看| eeuss影院久久| 丰满乱子伦码专区| 性色avwww在线观看| 性欧美人与动物交配| 黄色丝袜av网址大全| 9191精品国产免费久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品电影一区二区在线| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费观看人在逋| 在线观看日韩欧美| www.熟女人妻精品国产| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线播放无遮挡| 国产一区二区三区视频了| 美女免费视频网站| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美成人a在线观看| 免费在线观看成人毛片| 99热这里只有是精品50| 无限看片的www在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 黄色女人牲交| 日韩欧美免费精品| 久久性视频一级片| 精品日产1卡2卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| www日本黄色视频网| 天堂动漫精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 免费在线观看成人毛片| 精品国内亚洲2022精品成人| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲激情在线av| 69人妻影院| 热99re8久久精品国产| 国产av一区在线观看免费| 搞女人的毛片| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久中文看片网| 极品教师在线免费播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 精品乱码久久久久久99久播| 51午夜福利影视在线观看| 一级作爱视频免费观看| 国产av一区在线观看免费| 欧美日韩精品网址| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久香蕉精品热| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久精品综合一区二区三区| 中国美女看黄片| 国产v大片淫在线免费观看| 丁香六月欧美| 网址你懂的国产日韩在线| 在线视频色国产色| АⅤ资源中文在线天堂| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲人与动物交配视频| 观看免费一级毛片| 激情在线观看视频在线高清| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲精华国产精华精| 久久草成人影院| 在线播放无遮挡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 嫁个100分男人电影在线观看| 日本三级黄在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 两个人的视频大全免费| 亚洲国产精品999在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品免费一区二区三区在线| 美女黄网站色视频| 久久亚洲真实| 精品日产1卡2卡| 亚洲最大成人中文| 国产三级在线视频| 亚洲av电影在线进入| 99精品久久久久人妻精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲美女视频黄频| 91久久精品国产一区二区成人 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 黄色视频,在线免费观看| 国内精品久久久久久久电影| 午夜视频国产福利| 国产乱人视频| 国产三级黄色录像| 操出白浆在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲,欧美精品.| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产高清三级在线| 成人国产综合亚洲| 啦啦啦免费观看视频1| 69人妻影院| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| av中文乱码字幕在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 美女 人体艺术 gogo| 午夜视频国产福利| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久久大精品| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产欧美日韩精品一区二区| 不卡一级毛片| 亚洲av美国av| 免费观看的影片在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 在线天堂最新版资源| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 在线观看午夜福利视频| 欧美大码av| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99热只有精品国产| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 精品一区二区三区人妻视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产淫片久久久久久久久 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 免费人成在线观看视频色| 1000部很黄的大片| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲内射少妇av| 一级黄片播放器| 一区二区三区国产精品乱码| 99国产极品粉嫩在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 日本黄色片子视频| 特级一级黄色大片| 一a级毛片在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 波多野结衣高清作品| 青草久久国产| 最新美女视频免费是黄的| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产伦精品一区二区三区四那| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美一级毛片孕妇| 一个人看的www免费观看视频| 精品乱码久久久久久99久播| 禁无遮挡网站| 一级毛片女人18水好多| 午夜福利高清视频| 乱人视频在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品福利观看| 18禁国产床啪视频网站| 午夜精品在线福利| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品影院久久| 欧美zozozo另类| 国产久久久一区二区三区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99热只有精品国产| 熟女人妻精品中文字幕| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 丁香欧美五月| 亚洲国产精品成人综合色| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 一个人观看的视频www高清免费观看| www.熟女人妻精品国产| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 日本黄色片子视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲av免费在线观看| 久99久视频精品免费| 在线观看舔阴道视频| 国产精品av视频在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产在视频线在精品| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 很黄的视频免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 最新中文字幕久久久久| 禁无遮挡网站| 麻豆一二三区av精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久精品91无色码中文字幕| 国内精品久久久久精免费| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一夜夜www| 国产激情偷乱视频一区二区| 动漫黄色视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 日本免费a在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久久久国产a免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 国语自产精品视频在线第100页| 黄片小视频在线播放| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产伦一二天堂av在线观看| 一区福利在线观看| 日韩av在线大香蕉| 亚洲av不卡在线观看| 熟女电影av网| 床上黄色一级片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 男女之事视频高清在线观看| 国产久久久一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| а√天堂www在线а√下载| 精品久久久久久久久久久久久| 国产极品精品免费视频能看的| 露出奶头的视频| 欧美中文综合在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 香蕉丝袜av| 午夜久久久久精精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费看十八禁软件| netflix在线观看网站| 国产精品,欧美在线| 国产视频内射| 小说图片视频综合网站| a级毛片a级免费在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 欧美zozozo另类| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲乱码一区二区免费版| 一本久久中文字幕| 国产午夜精品论理片| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜久久久久精精品| 亚洲精品在线观看二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 人人妻人人看人人澡| 国产精品,欧美在线| 久久久久性生活片| 亚洲成人免费电影在线观看| av在线天堂中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 国产野战对白在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 无限看片的www在线观看| 天堂动漫精品| 成人亚洲精品av一区二区| 两个人的视频大全免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 麻豆一二三区av精品| 最新中文字幕久久久久| 午夜激情福利司机影院| 免费av不卡在线播放| 免费大片18禁| 99热这里只有是精品50| 最好的美女福利视频网| 男人的好看免费观看在线视频| 一本综合久久免费| 波多野结衣高清作品| 校园春色视频在线观看| 亚洲 国产 在线| 午夜老司机福利剧场| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 精品日产1卡2卡| 亚洲专区中文字幕在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日韩国产亚洲二区| 深夜精品福利| 欧美丝袜亚洲另类 | 麻豆成人午夜福利视频| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久精品欧美日韩精品| 国内精品美女久久久久久| 中文字幕熟女人妻在线| 国产综合懂色| 国产真人三级小视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜两性在线视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 香蕉久久夜色| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| av天堂在线播放| 99在线视频只有这里精品首页| 99久久九九国产精品国产免费| 九九热线精品视视频播放| 国产精品 欧美亚洲| 午夜影院日韩av| 国产精华一区二区三区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品综合一区二区三区| 久久人妻av系列| 丁香欧美五月| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久久中文| 制服人妻中文乱码| 午夜a级毛片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美性感艳星| 一级毛片女人18水好多| 久久久成人免费电影| 人妻久久中文字幕网| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩亚洲欧美综合| 麻豆成人av在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产欧美人成| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国产不卡一卡二| 首页视频小说图片口味搜索| 成人国产一区最新在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产视频一区二区在线看| 亚洲国产精品成人综合色| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美性猛交黑人性爽| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产不卡一卡二| 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品人妻少妇| 久久性视频一级片| 亚洲av二区三区四区| 极品教师在线免费播放| 中文字幕av在线有码专区| 国产成人福利小说| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品国产清高在天天线| 91麻豆av在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 一进一出好大好爽视频| 内地一区二区视频在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成年免费大片在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产美女午夜福利| 久久久久久九九精品二区国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 免费av不卡在线播放| 夜夜爽天天搞| 99久久九九国产精品国产免费| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 18禁在线播放成人免费| 少妇的逼水好多| 亚洲av成人av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美bdsm另类| 特大巨黑吊av在线直播| 无遮挡黄片免费观看| e午夜精品久久久久久久| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲成av人片免费观看| 久久精品91蜜桃| 男人的好看免费观看在线视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 麻豆成人av在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国语自产精品视频在线第100页| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产乱人伦免费视频| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩国产亚洲二区| 中文字幕熟女人妻在线| 看黄色毛片网站| 欧美一区二区亚洲| 特级一级黄色大片| 男女之事视频高清在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 午夜亚洲福利在线播放| 免费看光身美女| 天美传媒精品一区二区| 欧美日本视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一本综合久久免费| 18禁美女被吸乳视频| 岛国在线观看网站| 久久久久久久精品吃奶| 欧美日韩精品网址| 男女视频在线观看网站免费| h日本视频在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲av一区综合| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲无线观看免费| 欧美性感艳星| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产高清有码在线观看视频| 国产乱人伦免费视频| 性色avwww在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久9热在线精品视频| 91字幕亚洲| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 舔av片在线| 亚洲国产精品合色在线| 色播亚洲综合网| 一区二区三区激情视频| 成人av在线播放网站| 午夜免费成人在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av国产免费在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 一进一出好大好爽视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 色综合婷婷激情| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 色噜噜av男人的天堂激情| 99久久成人亚洲精品观看| 精品乱码久久久久久99久播| 免费人成在线观看视频色| or卡值多少钱| 一个人看视频在线观看www免费 | 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 两个人看的免费小视频| 天堂√8在线中文| 9191精品国产免费久久| 天美传媒精品一区二区| 欧美最新免费一区二区三区 | 久久久精品欧美日韩精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成人18禁在线播放| 亚洲av美国av| 成人欧美大片| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 男人的好看免费观看在线视频| 中文字幕av成人在线电影| 欧美3d第一页| 一a级毛片在线观看|