• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-19a對(duì)腹主動(dòng)脈瘤血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移及炎癥浸潤(rùn)的影響

    2020-07-24 11:54:50歐陽(yáng)勇劉彥葉洋波
    關(guān)鍵詞:主動(dòng)脈靶向試劑盒

    歐陽(yáng)勇,劉彥,葉洋波

    (杭州市富陽(yáng)區(qū)第一人民醫(yī)院 血管外科,浙江 杭州 311400)

    腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是常見(jiàn)的慢性主動(dòng)脈退行性疾病,具有高發(fā)病率和高病死率,嚴(yán)重危害中老年人生命健康。臨床研究發(fā)現(xiàn),主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)異常增殖、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和基質(zhì)降解與AAA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。但是,有關(guān)AAA發(fā)展過(guò)程中的炎癥浸潤(rùn)和VSMCs增殖和凋亡的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(miRNA)在AAA組織中異常表達(dá),且與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。已有研究表明,過(guò)表達(dá)miRlet-7a可下調(diào)炎癥反應(yīng)[4],過(guò)表達(dá)miR-21可抑制VSMCs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)AAA的發(fā)展[5]。此外,LIU等[6]研究發(fā)現(xiàn),miR-19a在AAA組織中高表達(dá),但其在AAA的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-19a在AAA患者AAA組織和血清中的表達(dá)水平,探討miR-19a對(duì)主動(dòng)脈VSMCs生物學(xué)行為以及炎癥浸潤(rùn)的影響和作用機(jī)制,以期為AAA臨床治療提供潛在靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 收集臨床樣本:組織標(biāo)本為2015年3月至2017年6月于杭州市富陽(yáng)區(qū)第一人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的15例AAA患者的腹主動(dòng)脈組織和器官移植中心行肝臟、腎臟器官移植術(shù)(供體排除AAA以及其他腹主動(dòng)脈相關(guān)病變)15例患者殘留的部分正常腹主動(dòng)脈組織。血清樣本來(lái)源于15例AAA患者和同期進(jìn)行體檢的15例健康者。手術(shù)前均告知患者并簽署知情同意書(shū),并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.1.2 細(xì)胞和主要試劑:人主動(dòng)脈VSMCs(BNCC340185)和人單核巨噬細(xì)胞THP-1(BNCC100407)均購(gòu)自廣州北納生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12和α-MEM、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;miR-19a inhibitor/mimic,pcDNA3.1-CDKN2B質(zhì)粒以及陰性對(duì)照均由上海吉馬公司合成;TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;LipofectamineTM3000和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司;ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司;兔抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B,CDKN2B)、β-actin單克隆抗體和HRP山羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;青霉素、鏈霉素、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

    1.2 方法

    1.2.1 巨噬細(xì)胞分離和培養(yǎng):采用淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基從AAA患者和健康體檢者外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞。采用PBS緩沖液按照1:1的比例稀釋肝素化的血清,2000 r/min離心20 min,收集乳白上清液,再加入4 mL細(xì)胞洗滌液于2000 r/min離心20 min即可得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。隨后,將分離得到的外周血單核細(xì)胞懸液置于含有10%的胎牛血清、雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)、25 ng/mL單核細(xì)胞集落刺激因子的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:采用含有10%的胎牛血清和雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)VSMCs和采用RPMI-1640培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí),以2×105個(gè)/孔的濃度接種到6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。鋪板24 h內(nèi),培養(yǎng)至細(xì)胞單層密度達(dá)到50%~60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將VSMCs或THP-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-19a inhibitor、miR-19a mimic和pcDNA3.1-CDKN2B。轉(zhuǎn)染后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h,更換雙倍血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)miR-19a的表達(dá)水平:收集組織、血清樣本和處理后的細(xì)胞,采用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA,并采用NanoDrop檢測(cè)RNA的濃度。隨后,采用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,嚴(yán)格按照qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-19a表達(dá)水平,以U6為內(nèi)參。miR-19a上游引物為5’-CTGGAGTGTGCAAATCTA TGC-3’,下游引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’,下游引物為5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平:收集處于對(duì)數(shù)期的VSMCs和THP-1細(xì)胞,采用RAPI裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白,檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行10% SDS-PAGE分離蛋白、電轉(zhuǎn)膜法將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后分別加入CDKN2B(1:1000)和β-actin抗體(1:1000),4 ℃孵育過(guò)夜。之后,加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1:2000)室溫孵育2 h。最后,進(jìn)行ECL染色,凝膠成像儀采集圖像;通過(guò)ImageJ分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.5 CCK-8檢測(cè)VSMCs細(xì)胞增殖活力:將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以2×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中,并在每孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基(含有50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清),每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后,向每孔中加入10 μL CCK-8溶液(0.5 mg/mL)后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h后,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的每孔光密度(OD450)值。

    1.2.6 Transwell檢測(cè)VSMCs細(xì)胞遷移能力:將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的VSMCs細(xì)胞培養(yǎng)至處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,以1×105個(gè)/孔的濃度接種于Transwell小室上室,下室加入500 μL混合培養(yǎng)基(250 μL巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液和250 μL DMEM/F12培養(yǎng)基)后常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,并于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)算侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMCs凋亡情況:取各組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于96孔板中,過(guò)夜培養(yǎng)后用胰蛋白酶消化細(xì)胞,PBS洗滌后加入300 μL結(jié)合液重懸,加入10 μL Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min,再加入5 μL PI溶液染色,混合均勻后避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比。

    1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-19a和CDKN2B的靶向關(guān)系:由湖南普拉特澤生物科技有限公司構(gòu)建CDKN2B基因的3’UTR,插入pGL3-Promoter質(zhì)粒載體中,將該重組質(zhì)粒命名為pGL3-CDKN2B-3’UTR WT,采用基因突變法定點(diǎn)突變獲得CDKN2B突變型載體(pGL3-CDKN2B-3’UTR MUT)。然后,將HEK 293T細(xì)胞接種于12孔板中,待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%~70%時(shí)分別將miR-19a mimic和mimic-NC,CDKN2B野生型載體、CDKN2B突變型載體共轉(zhuǎn)染于HEK 293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6 h后更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)36 h。最后,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.9 ELISA檢測(cè)炎性因子的表達(dá)水平:將經(jīng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染處理的THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有50%巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液RPMI-1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)結(jié)束后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示,2組比較采用t檢驗(yàn),多組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-19a在AAA組織和血清中高表達(dá) RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-19a在AAA組織中的表達(dá)水平明顯高于正常腹主動(dòng)脈組織(P<0.01)。與健康組比,miR-19a在AAA患者血清中的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

    圖1 miR-19a在AAA患者組織(A)和血清(B)中的表達(dá)

    2.2 敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,敲降miR-19a可明顯下調(diào)miR-19a在VSMCs中的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖2A;CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,敲降miR-19a后VSMCs增殖活力明顯低于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖2B;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,敲降miR-19a可顯著誘導(dǎo)VSMCs凋亡水平(P<0.01),見(jiàn)圖2C;Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs遷移能力(P<0.01),見(jiàn)圖2D。

    2.3 敲降miR-19a抑制THP-1細(xì)胞炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的表達(dá) ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖3A-C。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,敲降miR-19a可明顯抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖3D。由此可知,敲降miR-19a可明顯抑制THP-1細(xì)胞中炎癥因子和THP-1細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)水平。

    圖2 敲降miR-19a對(duì)VSMCs增殖、凋亡和遷移(×100)的影響

    2.4 miR-19a靶向負(fù)調(diào)CDKN2B的表達(dá) 通過(guò)比對(duì)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),CDKN2B是miR-19a的潛在靶基因,其結(jié)合位點(diǎn)如圖4A所示。同時(shí),雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明,相比于對(duì)照組(mimic-NC),過(guò)表達(dá)miR-19a可顯著減少野生型CDKN2B質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01),但對(duì)突變型CDKN2B質(zhì)粒熒光素酶的活性沒(méi)有影響,見(jiàn)圖4B。Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-19a可顯著下調(diào)VSMCs中CDKN2B蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),見(jiàn)圖4C。

    2.5 miR-19a靶向CDKN2B抑制VSMCs增殖、侵襲和誘導(dǎo)凋亡 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著上調(diào)VSMCs中CDKN2B蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),但同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-19a和CDKN2B后VSMCs中CDKN2B的表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖5A。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著抑制VSMCs增殖活力(P<0.01),見(jiàn)圖5B。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著誘導(dǎo)VSMCs凋亡水平(P<0.01),見(jiàn)圖5C。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)CDKN2B后VSMCs遷移能力明顯低于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖5D。但同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-19a和CDKN2B后可明顯緩解僅過(guò)表達(dá)CDKN2B對(duì)VSMCs增殖、凋亡和遷移的調(diào)控作用(P<0.01),見(jiàn)圖5B-D。

    圖3 敲降miR-19a對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥因子和MMP表達(dá)的影響

    2.6 miR-19a靶向CDKN2B下調(diào)THP-1細(xì)胞炎癥因子和MMPs的表達(dá)水平 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著下調(diào)TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平(P<0.01),但同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-19a和CDKN2B可緩解僅過(guò)表達(dá)CDKN2B對(duì)炎癥因子的抑制作用(P<0.01),見(jiàn)圖6。Western blot檢測(cè)證實(shí),相比于對(duì)照組,過(guò)表達(dá)CDKN2B可顯著抑制MCP-1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平(P<0.01);但同時(shí)過(guò)表達(dá)CDKN2B和miR-19a后MCP-1、MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5A。

    3 討論

    AAA是一種嚴(yán)重的遲發(fā)性血管疾病,病死率高。近年來(lái),miRNA被廣泛報(bào)道通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為,進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。LI等[7]研究表明,miR-19a可作為心臟、血管和神經(jīng)元相關(guān)疾病的早期診斷和治療靶點(diǎn)。MENG等[8]研究發(fā)現(xiàn),miR-183和miR-141與AAA的不良預(yù)后密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)miR-155-3p通過(guò)促進(jìn)VSMCs的增殖和抑制細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)AAA的發(fā)生與發(fā)展[9]。PENG等[10]研究表明,過(guò)表達(dá)miR-26a通過(guò)靶向PTEN促進(jìn)VSMCs增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而誘導(dǎo)AAA的發(fā)展。同時(shí),前期研究也證實(shí),異常表達(dá)的miR-19a與炎癥和腫瘤密切相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,miR-19a在AAA主動(dòng)脈壁組織和血清中高表達(dá);敲降miR-19a可顯著抑制VSMCs增殖和遷移能力,以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí),敲降miR-19a抑制了THP-1細(xì)胞因子和MMPs的表達(dá)。機(jī)制上,miR-19a通過(guò)靶向下調(diào)CDKN2B的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)VSMCs增殖和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá),從而加速AAA的發(fā)展進(jìn)程。

    圖5 miR-19a靶向CDKN2B對(duì)VSMCs增殖、凋亡和細(xì)胞遷移(×100)的影響

    圖6 miR-19a靶向CDKN2B對(duì)THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響

    巨噬細(xì)胞是炎癥和免疫學(xué)的關(guān)鍵細(xì)胞之一,miR-19a在多種炎癥遞質(zhì)作用下表達(dá)增強(qiáng)[13-14]。巨噬細(xì)胞的存在可損傷動(dòng)脈壁,因?yàn)榫奘杉?xì)胞產(chǎn)生的MMPs可以降解血管管壁中層彈力纖維,造成血管壁順應(yīng)性降低,并在血流的沖擊作用下加劇瘤體擴(kuò)張,使膠原蛋白產(chǎn)生崩解[15]。例如,敲降miR-33-5p可通過(guò)緩解THP-1炎癥因子的表達(dá)和MMPs的表達(dá),進(jìn)而緩解AAA的發(fā)展進(jìn)程[16]。同時(shí),ZHANG等[17]研究結(jié)果證實(shí),敲降miR-155通過(guò)抑制THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá),進(jìn)而緩解血管緊張素II誘導(dǎo)小鼠AAA形成。miR-195通過(guò)抑制炎性因子和MMPs的表達(dá),緩解了AAA的發(fā)展進(jìn)程[18]。與前期研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)miR-19a水平在AAA患者組織和血清中高表達(dá)。同時(shí),敲降miR-19a抑制了THP-1細(xì)胞上清液中炎癥因子的表達(dá)水平以及主動(dòng)脈彈性蛋白的表達(dá)。此外,過(guò)表達(dá)miR-19a促進(jìn)了VSMCs的遷移。以上研究結(jié)果提示,抑制炎癥反應(yīng)和MMPs的表達(dá)可預(yù)防AAA動(dòng)脈壁破裂的發(fā)生。

    CDKN2B作為多種惡性腫瘤的抑癌基因,通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞增殖、周期和凋亡進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[19-20]。在血管系統(tǒng)中,CDKN2B通過(guò)介導(dǎo)p53參與血管重塑[21]。LEEPER等[22]研究表明,敲降CDKN2B通過(guò)上調(diào)p53的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈瘤的形成。GAO等[23]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-15a通過(guò)靶向抑制CDKN2B上調(diào)平滑肌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)AAA的發(fā)展進(jìn)程。同時(shí),本研究結(jié)果同樣證實(shí),敲降miR-19a通過(guò)靶向上調(diào)CDKN2B抑制平滑肌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,以及緩解THP-1細(xì)胞上清炎癥因子和MMPs的表達(dá),進(jìn)而緩解AAA的發(fā)展進(jìn)程。由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)資料我們推斷,miR-19a/CDKN2B分子軸在AAA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,并且調(diào)控VSMCs增殖、凋亡和細(xì)胞遷移以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但其能否作為新的治療靶點(diǎn)投入到臨床中還需要進(jìn)一步深入研究。

    猜你喜歡
    主動(dòng)脈靶向試劑盒
    如何判斷靶向治療耐藥
    MUC1靶向性載紫杉醇超聲造影劑的制備及體外靶向?qū)嶒?yàn)
    毛必靜:靶向治療,你了解多少?
    肝博士(2020年5期)2021-01-18 02:50:18
    Stanford A型主動(dòng)脈夾層手術(shù)中主動(dòng)脈假腔插管的應(yīng)用
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
    靶向超聲造影劑在冠心病中的應(yīng)用
    護(hù)理干預(yù)預(yù)防主動(dòng)脈夾層介入治療術(shù)后并發(fā)癥
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    胸腹主動(dòng)脈置換術(shù)后感染并發(fā)癥救治一例
    女性生殖器流出的白浆| 亚洲av福利一区| 22中文网久久字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看| av专区在线播放| av在线老鸭窝| 亚洲美女搞黄在线观看| 51国产日韩欧美| 曰老女人黄片| 国产成人aa在线观看| 9色porny在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲内射少妇av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久精品久久久久真实原创| 街头女战士在线观看网站| 欧美三级亚洲精品| 国产精品久久久久久久电影| 精品熟女少妇av免费看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产男女超爽视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频 | 久久久a久久爽久久v久久| 久久久久久久国产电影| 香蕉精品网在线| av女优亚洲男人天堂| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美清纯卡通| 国产在视频线精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲av不卡在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| av天堂中文字幕网| 国产精品久久久久久久电影| 日韩欧美一区视频在线观看 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本黄大片高清| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片 | 成人毛片a级毛片在线播放| 两个人的视频大全免费| av.在线天堂| 人妻夜夜爽99麻豆av| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| freevideosex欧美| 亚洲av日韩在线播放| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品久久久久久久电影| 寂寞人妻少妇视频99o| 日本黄大片高清| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲天堂av无毛| 日韩精品有码人妻一区| 99热网站在线观看| 一级a做视频免费观看| 青青草视频在线视频观看| 国产成人a∨麻豆精品| 高清欧美精品videossex| 日韩欧美精品免费久久| 国产片特级美女逼逼视频| videossex国产| 久久久久精品性色| 少妇熟女欧美另类| 九九爱精品视频在线观看| 一个人免费看片子| a级一级毛片免费在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 免费看光身美女| 欧美三级亚洲精品| 91aial.com中文字幕在线观看| av福利片在线| 精品一区二区免费观看| 午夜激情久久久久久久| 欧美性感艳星| 成人无遮挡网站| 简卡轻食公司| 亚洲av不卡在线观看| 日韩视频在线欧美| 两个人免费观看高清视频 | 亚洲精品乱久久久久久| 久久久国产一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲成人手机| 亚洲国产色片| 91精品国产九色| 老女人水多毛片| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品aⅴ在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久久久久久av| 久久久久久久精品精品| 嫩草影院入口| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩视频在线欧美| 亚洲无线观看免费| 欧美区成人在线视频| 2022亚洲国产成人精品| 我的女老师完整版在线观看| 国产亚洲最大av| 久久久久久久精品精品| 婷婷色综合www| 青春草国产在线视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 日韩电影二区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人精品久久久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产一区二区在线观看av| 国产精品一区二区在线不卡| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 国产精品国产av在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 一区二区三区乱码不卡18| 在线免费观看不下载黄p国产| 久热久热在线精品观看| 国产av一区二区精品久久| 一个人看视频在线观看www免费| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产精品一区二区性色av| 亚洲天堂av无毛| 一边亲一边摸免费视频| 日本欧美视频一区| 亚洲在久久综合| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人综合一区亚洲| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品乱久久久久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 高清毛片免费看| 国产在线男女| 在线精品无人区一区二区三| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲自偷自拍三级| 久久97久久精品| 在线 av 中文字幕| 免费看日本二区| 成年女人在线观看亚洲视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久ye,这里只有精品| 国产免费视频播放在线视频| 曰老女人黄片| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品国产av在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人精品无人区| 成人国产麻豆网| 亚洲欧洲日产国产| 午夜91福利影院| 色视频www国产| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久鲁丝午夜福利片| 男的添女的下面高潮视频| 国产一区二区在线观看av| 欧美性感艳星| 亚洲欧美一区二区三区国产| 精品亚洲成国产av| 欧美+日韩+精品| 永久免费av网站大全| www.色视频.com| 视频中文字幕在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇的逼水好多| 国产精品久久久久久久电影| 精华霜和精华液先用哪个| av一本久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 简卡轻食公司| 亚洲av综合色区一区| 国产成人a∨麻豆精品| 综合色丁香网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲综合精品二区| 超碰97精品在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 男女国产视频网站| 精品人妻熟女av久视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 97超视频在线观看视频| 在线观看免费高清a一片| 日本黄色片子视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 中国三级夫妇交换| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产成人精品久久久久久| 国产成人91sexporn| 免费观看无遮挡的男女| 色视频www国产| 尾随美女入室| 久久热精品热| 日韩三级伦理在线观看| 黄色毛片三级朝国网站 | 日韩人妻高清精品专区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲综合精品二区| 亚洲不卡免费看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品国产国语对白av| av在线老鸭窝| 91久久精品电影网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品少妇内射三级| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产高清不卡午夜福利| 精品一区二区免费观看| 精品久久久精品久久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 宅男免费午夜| 中国美女看黄片| 黑人猛操日本美女一级片| 丝袜脚勾引网站| 热99久久久久精品小说推荐| 免费高清在线观看视频在线观看| 正在播放国产对白刺激| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品国产av在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美日韩福利视频一区二区| 黄色a级毛片大全视频| 妹子高潮喷水视频| h视频一区二区三区| 国产成人精品无人区| 99热网站在线观看| 免费日韩欧美在线观看| av在线老鸭窝| 免费观看人在逋| 久久这里只有精品19| 大片免费播放器 马上看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品.久久久| 一区在线观看完整版| av天堂久久9| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一个人免费看片子| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 婷婷色av中文字幕| 十八禁网站网址无遮挡| 男人操女人黄网站| 精品第一国产精品| 悠悠久久av| 大香蕉久久网| e午夜精品久久久久久久| 国产1区2区3区精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产在线免费精品| 日本av免费视频播放| 黄片播放在线免费| 美女视频免费永久观看网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 青青草视频在线视频观看| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲国产精品999| 一区二区三区精品91| 午夜免费鲁丝| 美女视频免费永久观看网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| tocl精华| 黄色毛片三级朝国网站| 自线自在国产av| 久久久国产精品麻豆| 亚洲伊人久久精品综合| 不卡av一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 国产色视频综合| 国产成人免费无遮挡视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品乱久久久久久| 女性被躁到高潮视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文字幕最新亚洲高清| 国产亚洲一区二区精品| 国产三级黄色录像| 国产一区二区在线观看av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产主播在线观看一区二区| 男女边摸边吃奶| 两个人看的免费小视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品人妻在线不人妻| 伊人亚洲综合成人网| 欧美精品av麻豆av| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久精品人妻al黑| 99热网站在线观看| a 毛片基地| 午夜福利一区二区在线看| 两性夫妻黄色片| 午夜日韩欧美国产| 精品亚洲成国产av| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产高清国产精品国产三级| 飞空精品影院首页| 国产精品av久久久久免费| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 我要看黄色一级片免费的| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 香蕉国产在线看| 国产精品久久久久成人av| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 少妇精品久久久久久久| 丝袜人妻中文字幕| 老司机午夜福利在线观看视频 | 99精品欧美一区二区三区四区| bbb黄色大片| 国产精品久久久久成人av| 国产免费av片在线观看野外av| 久久九九热精品免费| 国产成人免费无遮挡视频| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品第一国产精品| 亚洲 国产 在线| 国产福利在线免费观看视频| 搡老乐熟女国产| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久国产精品麻豆| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品中文字幕在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品在线美女| 99国产综合亚洲精品| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 天天添夜夜摸| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品免费大片| 12—13女人毛片做爰片一| 精品免费久久久久久久清纯 | 黄色视频不卡| 日韩制服骚丝袜av| 手机成人av网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人av一区二区三区在线看 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 人妻一区二区av| 日韩大片免费观看网站| 97人妻天天添夜夜摸| 一个人免费在线观看的高清视频 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一区二区三区四区激情视频| 午夜免费观看性视频| e午夜精品久久久久久久| 超碰97精品在线观看| 永久免费av网站大全| 大片免费播放器 马上看| 在线精品无人区一区二区三| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品人妻1区二区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 午夜福利免费观看在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 搡老岳熟女国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 不卡一级毛片| 国产黄色免费在线视频| av不卡在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 老汉色∧v一级毛片| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲伊人色综图| 一本色道久久久久久精品综合| 美女午夜性视频免费| 国产精品欧美亚洲77777| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 五月开心婷婷网| 一级毛片精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 老司机亚洲免费影院| 中亚洲国语对白在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 视频区图区小说| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美中文综合在线视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 大片免费播放器 马上看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产在线一区二区三区精| 免费在线观看黄色视频的| 97在线人人人人妻| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲少妇的诱惑av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线观看免费高清a一片| 日韩欧美免费精品| 手机成人av网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美 日韩 精品 国产| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品免费大片| 国产伦理片在线播放av一区| 丁香六月欧美| 国产有黄有色有爽视频| 曰老女人黄片| 大香蕉久久成人网| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩大片免费观看网站| 人妻 亚洲 视频| 午夜免费鲁丝| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美国产精品va在线观看不卡| a级毛片在线看网站| 国产精品久久久久久精品古装| 视频区图区小说| 免费少妇av软件| 成人影院久久| 日韩三级视频一区二区三区| 一本久久精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品一二三区在线看| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品久久久av美女十八| 成人影院久久| 女人久久www免费人成看片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 中文字幕av电影在线播放| 91av网站免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 欧美精品高潮呻吟av久久| 搡老乐熟女国产| 视频区欧美日本亚洲| 岛国在线观看网站| 久久九九热精品免费| 午夜免费成人在线视频| 老司机福利观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲中文日韩欧美视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费不卡黄色视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久 成人 亚洲| 满18在线观看网站| 欧美日韩黄片免| 最新在线观看一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三 | 久久av网站| 99久久综合免费| 伊人亚洲综合成人网| 少妇粗大呻吟视频| 大码成人一级视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 在线观看舔阴道视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 91字幕亚洲| 美女扒开内裤让男人捅视频| 捣出白浆h1v1| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产成人影院久久av| 亚洲专区中文字幕在线| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产精品99久久99久久久不卡| 美女主播在线视频| 日韩视频在线欧美| 天堂8中文在线网| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 国产成人免费观看mmmm| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 搡老熟女国产l中国老女人| 丝袜人妻中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 成人影院久久| 国产av精品麻豆| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩欧美一区视频在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲精华国产精华精| www.自偷自拍.com| av一本久久久久| 老司机影院毛片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费不卡黄色视频| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品国产av成人精品| 成人手机av| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品久久午夜乱码| 大型av网站在线播放| 三上悠亚av全集在线观看| 国产男女内射视频| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品免费视频内射| 亚洲伊人久久精品综合| 成年动漫av网址| 男女国产视频网站| www.999成人在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲精品国产一区二区精华液| kizo精华| www.999成人在线观看| 免费在线观看日本一区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲天堂av无毛| 乱人伦中国视频| 91大片在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 不卡一级毛片| 国产男女内射视频| 一个人免费在线观看的高清视频 | 欧美在线一区亚洲| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 免费av中文字幕在线| 天天添夜夜摸| 久久久久久免费高清国产稀缺| 婷婷丁香在线五月| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产在视频线精品| 男人操女人黄网站| 国产主播在线观看一区二区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美在线黄色| 中文字幕高清在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 久久国产亚洲av麻豆专区| 又大又爽又粗| 搡老岳熟女国产| 真人做人爱边吃奶动态| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成人免费av在线播放| av国产精品久久久久影院| av网站免费在线观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本av手机在线免费观看| 电影成人av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 淫妇啪啪啪对白视频 | 精品久久久精品久久久| 亚洲天堂av无毛| 午夜福利一区二区在线看| 无限看片的www在线观看| 操出白浆在线播放| 久久中文看片网| 色老头精品视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机在亚洲福利影院| 桃花免费在线播放| 成年人免费黄色播放视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 最新在线观看一区二区三区| 岛国毛片在线播放|