響應(yīng)面法修飾花生蛋白制備姜黃素納米顆粒工藝條件的研究

李玟君姚娟娟鄧愛(ài)華楊勝平裘雨萱李 瑋

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院,湖北 武漢 430068)

姜黃素是一種生物性很強(qiáng)的天然二酮類(lèi)化合物,具有抗炎、抗氧化、調(diào)脂、抗病毒、抗感染、抗凝、抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等廣泛的藥理活性[1-2]。但是在應(yīng)用中存在著溶解度不高、穩(wěn)定性差等問(wèn)題導(dǎo)致了其生物利用度較低。花生蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、無(wú)毒無(wú)害,且與動(dòng)物性蛋白相比,不存在受病毒污染等安全性問(wèn)題[3-7],具有優(yōu)良的納米成粒性,是很好的制備納米顆粒的材料[6,8-9]。然而,花生蛋白的結(jié)構(gòu)為緊密的四級(jí)結(jié)構(gòu),無(wú)活性基團(tuán)暴露,需要進(jìn)行分子修飾使蛋白分子展開(kāi)來(lái)提高蛋白的凝膠性。

本實(shí)驗(yàn)利用超聲波輔助熱堿對(duì)提取的花生分離蛋白進(jìn)行改性,研究超聲波功率、堿液的pH、加熱溫度和處理時(shí)間等條件對(duì)花生蛋白分子結(jié)構(gòu)、姜黃素包埋率的影響,并利用響應(yīng)面分析法對(duì)花生蛋白的改性條件進(jìn)行優(yōu)化,為姜黃素和花生蛋白的高效利用提供新的思路。

1 試驗(yàn)方法

1.1 花生分離蛋白的制備

參考馬鐵錚[7]的方法,略有改動(dòng)。花生仁干燥后脫紅衣,粉碎過(guò)60目篩后,加入5倍質(zhì)量體積的石油醚脫脂,浸提2h,4℃,6000r/min離心5min,重復(fù)浸提脫脂三次后離心所得固體殘?jiān)凑召|(zhì)量比為1∶5的量加10%的NaOH調(diào)漿,調(diào)節(jié)pH=9,攪拌后6000r/min離心5min收集濾液,用8% HCl調(diào)節(jié)濾液pH=4后靜置1 h,收集沉淀,將沉淀用去離子水洗滌至中性后凍藏,用真空冷凍干燥機(jī)干燥72 h所得樣品備用。

1.2 不同修飾條件的花生分離蛋白的制備(單因素實(shí)驗(yàn))

考察不同修飾條件對(duì)花生分離蛋白包埋姜黃素的效果。稱(chēng)取10g花生分離蛋白溶解于100mL堿液中,控制超聲波功率和水浴溫度對(duì)花生分離蛋白進(jìn)行改性修飾,控制堿液pH分別為7、8、9、10、11、12、13,超聲波功率為0、50、100、150、200、250、300W,溫度為70、75、80、85、90、95、100℃,加熱時(shí)間為10min,上述操作完成后靜置冷卻至室溫后6000r/min離心5min收集濾液,用8% HCl調(diào)節(jié)濾液pH=4后靜置1 h,收集沉淀,將沉淀用去離子水洗滌至中性后凍藏,用真空冷凍干燥機(jī)干燥72 h后收集樣品,即得不同修飾條件制備的修飾花生蛋白。稱(chēng)取6g修飾后的花生蛋白溶于100mL雙蒸水中配制成修飾花生蛋白溶液備用。

1.3 修飾蛋白總巰基含量和二硫鍵含量的測(cè)定

總巰基含量的測(cè)定參考Beveridge等改進(jìn)的Ellman 試劑法[12]?？値€基的測(cè)定主要參考Hu等的方法[13]。

1.4 花生蛋白包埋姜黃素顆粒的制備

稱(chēng)取0.5g姜黃素溶于1L無(wú)水乙醇中配制質(zhì)量濃度為0.05%姜黃素乙醇溶液,取30 mL姜黃素乙醇溶液與50mL的1.3.2中各種修飾條件制備的花生蛋白溶液混勻后,避光攪拌反應(yīng)2h。再向混合溶液中加入5mmol/L的CaCl280mL,室溫下靜置16 h后使用14000D的透析袋進(jìn)行脫鹽處理72 h,冷凍干燥后即得包埋姜黃素的固體花生蛋白顆粒。

1.5 包埋率的測(cè)定

參考Laura G的方法,用高效液相色譜測(cè)定[14]。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù) Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,依據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取堿液pH(P),加熱溫度(T),超聲波功率(Q)和反應(yīng)時(shí)間(S)四個(gè)因素,以姜黃素包埋率(d)為指標(biāo),設(shè)計(jì)四因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用OriginPro 2007 (OriginLab Corporation, USA)和 SAS 8.1 (North Carolina State University, US)處理,測(cè)量結(jié)果平均值±偏差(±std)表示,顯著性水平為0.05和0.01,不同字母表示同列數(shù)據(jù)間的差異程度(p＜0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾條件對(duì)花生分離蛋白游離巰基和二硫鍵含量的影響

2.1.1 堿液pH對(duì)花生分離蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可得到,在7≤pH≤11的范圍內(nèi),隨著堿液pH值的升高,花生分離蛋白游離巰基的含量從10.35±0.63μmol/g(pH=7)逐漸增大至?xí)r18.26±0.93μmol/g (pH=10)并保持不變;二硫鍵的含量從44.62±0.48μmol/g(pH=7)減小至34.26±2.03μmol/g(pH=11)并保持不變,說(shuō)明當(dāng)pH值超過(guò)11時(shí),極端pH條件下可能會(huì)導(dǎo)致花生分離蛋白發(fā)生變性。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在堿性環(huán)境中,主鏈肽鍵斷裂導(dǎo)致一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,二級(jí)結(jié)構(gòu)也可能發(fā)生重大變化[19],強(qiáng)堿處理高濃度蛋白時(shí),蛋白質(zhì)的理化特性會(huì)發(fā)生較大變化,巰基與二硫鍵之間發(fā)生交換反應(yīng)[15]或者β-消除反應(yīng)等[16-17]。本實(shí)驗(yàn)中二硫鍵的含量與游離巰基含量的變化也證明了在堿性條件下花生分離蛋白分子基團(tuán)發(fā)生解離。

2.1.2 溫度對(duì)花生分離蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

圖1 堿液pH對(duì)花生分離蛋白分子游離巰基和二硫鍵含量的影響Fig.1 Effect of pH on the content of free thiol and disulfide

圖2 加熱溫度對(duì)花生分離蛋白分子游離巰基和二硫鍵含量的影響Fig.2 Effect of heating temperature on the content of free thiol and disulfide

由圖2可得到,在溫度為70℃≤T≤90℃的范圍內(nèi),隨溫度的升高,花生分離蛋白游離巰基的含量從10.35±0.94μmol/g(T=70℃)逐漸增大至19.67±0.68μmol/g(T=90℃)時(shí)溫度繼續(xù)升高,游離巰基的含量會(huì)逐漸下降至17.86±0.22 μmol/g(T=100℃);而二硫鍵的含量從45.02±2.84μmol/g(T=70℃)降低至34.26±2.03 μmol/g(T=90℃)。研究發(fā)現(xiàn)熱處理蛋白可以預(yù)先使蛋白質(zhì)的部分去折疊,降低了蛋白質(zhì)在界面上發(fā)生結(jié)構(gòu)展開(kāi)的能壘,熱處理蛋白具有較高的游離巰基,且內(nèi)卷于蛋白聚集體內(nèi)部,當(dāng)?shù)鞍孜接谟退缑婧?聚集體結(jié)構(gòu)展開(kāi)重排,利于游離巰基在界面上的氧化或與其他游離巰基接觸,即可形成二硫鍵,進(jìn)而提高了蛋白的膨脹模量[21-23,25]。本研究中游離巰基隨著加熱溫度升高而降低,二硫鍵含量卻呈現(xiàn)隨溫度升高而降低的趨勢(shì),有可能是加熱使得花生分離蛋白發(fā)生聚集,游離巰基內(nèi)卷,抑制了二硫鍵的形成。

圖3 超聲波功率對(duì)花生分離蛋白分子游離巰基和二硫鍵含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of free thiol and disulfide

2.1.3 超聲波功率對(duì)花生分離蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可得到,在超聲波功率Q≤300W的范圍內(nèi),隨功率升高,花生分離蛋白游離巰基的含量從12.44±0.73μmol/g逐漸增大至19.46±0.24μmol/g(Q=250W);二硫鍵的含量從42.29±1.24μmol/g減小至33.28±0.64μmol/g (Q=300W)。研究表明, 超聲波處理可以在蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生局部的極端溫度和壓力,可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而有利于蛋白質(zhì)在油水界面形成吸附層,蛋白質(zhì)在這種條件下容易發(fā)生去折疊化,從而暴露出更多的活性基團(tuán)[26-27]。

2.2 修飾條件對(duì)姜黃素包埋率的影響

圖4(a)可看到,加熱溫度在80～100℃的范圍內(nèi),隨著加熱溫度的增大,姜黃素的包埋率呈先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)加熱溫度為90 ℃時(shí),包埋率達(dá)到最大,為64.52±1.08%。因此選定加熱溫度為85、90、95℃作為作為包埋試驗(yàn)的優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖4(b)可看到,堿液pH值在9～13范圍內(nèi),隨著pH值的增加,姜黃素的包埋率呈先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)pH為10時(shí),包埋率達(dá)到最大,為75.68±1.64%,因此選定pH值為9、10、11作為包埋試驗(yàn)的優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖4(c)可看到,超聲波功率在100～300W的范圍內(nèi),隨著功率的增加,姜黃素的包埋率呈先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)功率為200W時(shí),包埋率達(dá)最大,為76.25±2.64%,因此選定功率為150、200、250W作為包埋試驗(yàn)的優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖4(d)可看到,加熱時(shí)間在5～25 min的范圍內(nèi),隨加熱時(shí)間延長(zhǎng),姜黃素的包埋率呈先增大后不變的趨勢(shì),當(dāng)加熱時(shí)間為15min或20min時(shí),包埋率達(dá)最大,因此選定加熱時(shí)間為15、20、25 min作為包埋試驗(yàn)的優(yōu)水平進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖4 蛋白修飾條件對(duì)姜黃素包埋率的影響Fig.4 Effects of protein modification conditions on the embedding rate of curcumin

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化姜黃素包埋工藝

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

利用SAS 8.1軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到姜黃素包埋率對(duì)堿液pH(P),加熱溫度(T),超聲波功率(Q)和加熱時(shí)間(S)的回歸模型:

d=-2968.59+42.18T+11.24S+151P+2.13Q-0.22T×T+0.127S×T-0.242S×S-0.285P×T-1.188P×S-5.12P×P-0.001Q×T-0.003Q×S+0.004P×Q-0.003Q×Q(R2=0.9306)

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of response surface analysis method

對(duì)該回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),并由統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)軟件進(jìn)行分析得表3,可知p＜0.0001,說(shuō)明該數(shù)據(jù)模型達(dá)到極顯著水平,R2=0.9306表明模型的擬合度好,說(shuō)明響應(yīng)值的改變有93.06%與自變量的改變有關(guān)。失擬度p=0.4803＞0.05,不顯著,表明回歸方程與實(shí)驗(yàn)值擬合較好,試驗(yàn)誤差小。根據(jù)F值大小可得出各因素對(duì)提取率的影響順序依次為:pH、溫度、時(shí)間、超聲功率。

圖5 pH與加熱時(shí)間的交互作用對(duì)姜黃素包埋率影響的等高線(xiàn)及響應(yīng)曲面Fig.5 Contour and response surface of the interaction between heating temperature and pH on the loading rate of curcumin

圖6 加熱溫度與時(shí)間的交互作用對(duì)姜黃素包埋率影響的等高線(xiàn)及響應(yīng)曲面Fig.6 Contour and response surface of the interaction between heating temperature and heating time on the loading rate of curcumin

由圖5響應(yīng)面及等高線(xiàn)數(shù)據(jù)分析可知:堿液pH與加熱時(shí)間S交互作用對(duì)姜黃素包埋率有極顯著性影響;反應(yīng)時(shí)間S與加熱溫度T交互作用對(duì)姜黃素包埋率影響較顯著(圖6)。

2.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證

由響應(yīng)面可知,模型存在穩(wěn)定點(diǎn),且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。通過(guò)響應(yīng)面法得到姜黃素包埋最優(yōu)工藝?yán)碚摋l件:堿液pH值(P)為9.8,加熱溫度(T)為90.45℃,超聲波功率(Q)為228.08W,加熱時(shí)間(S)為20.74 min;此條件下姜黃素包埋率為83.44%?？紤]實(shí)際操作的可行性,取pH=9.8,加熱溫度T=90℃,超聲波功率Q=225W,加熱時(shí)間S=21min,按此條件實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次得到的姜黃包埋率83.27±1.06%。與卵白蛋白[28]、蕓豆異源蛋白[29]為壁材制備的姜黃素納米顆粒相比工藝更簡(jiǎn)單,載荷更高。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究了超聲波輔助熱堿修飾對(duì)花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響和利用該修飾蛋白包埋姜黃素制備納米顆粒的工藝條件。研究發(fā)現(xiàn)在堿性范圍內(nèi),隨著堿液pH值的升高,花生分離蛋白游離巰基的含量逐漸增大,二硫鍵的含量逐漸減小;在超聲波功率為Q≤300W的范圍內(nèi),隨著功率的升高,花生分離蛋白游離巰基的含量逐漸增大,二硫鍵的含量逐漸減小;隨著溫度的升高,花生分離蛋白游離巰基的含量逐漸增大(70℃≤T≤90℃),溫度繼續(xù)升高,游離巰基的含量會(huì)逐漸下降至17.86±0.22μmol/g(T=100℃),而二硫鍵的含量逐漸降低(70℃≤T≤90℃)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù) Box-Benhnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),建立姜黃素包埋率的二次多項(xiàng)式回歸模型,并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)利用花生蛋白包埋姜黃素重要因素進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果顯示,超聲波輔助修飾花生蛋白包埋姜黃素最優(yōu)工藝參數(shù)為pH=9.8,加熱溫度T=90℃,超聲波功率Q=225W,加熱時(shí)間S=21min,該條件下姜黃素包埋率達(dá)到83.27±1.06%。利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助花生蛋白包埋姜黃素的工藝條件,可為擴(kuò)大姜黃素的應(yīng)用范圍,促進(jìn)花生加工業(yè)的技術(shù)進(jìn)步提供技術(shù)支持。