黃芩苷對老年大鼠脾切除后認(rèn)知功能障礙的影響

張建楠，周紅梅，蔡靚羽，蔣晨浩

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無錫醫(yī)院，江蘇 無錫 214071）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指術(shù)前無精神異常的患者，在術(shù)后出現(xiàn)包括認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶、思維活動等方面的障礙，是手術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）并發(fā)癥之一。一般認(rèn)為POCD是在中樞神經(jīng)退行性病變的基礎(chǔ)上，由多種類型的應(yīng)激刺激，例如手術(shù)、麻醉、藥物等，誘發(fā)或加重神經(jīng)退行性病變以及神經(jīng)元凋亡[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后認(rèn)知功能障礙的病變主要集中在大腦的海馬區(qū)域，海馬對于學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知的功能至關(guān)重要，但易受癲癇，局部缺血、缺氧或炎癥的損害[2]。尤其是NMDA受體亞型NR2B在此過程中起到了重要作用。NR2B通過調(diào)控NMDA受體和AMPA受體的膜轉(zhuǎn)運(yùn)及突觸傳遞過程，從而影響學(xué)習(xí)與記憶功能。

手術(shù)創(chuàng)傷可以產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。正常時，促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、TNFα）和抗炎細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）表達(dá)量趨于動態(tài)平衡，而在手術(shù)應(yīng)激等情況發(fā)生時，海馬區(qū)域的炎癥因子和抗炎細(xì)胞因子的失衡會造成中樞神經(jīng)(CNS)發(fā)生炎癥[3-4]，從而可能造成與海馬功能變化相關(guān)的POCD。

黃芩苷是從中藥黃芩的干燥根莖中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要藥理成分，具有抗病毒、抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等多種作用[5-8]。它可透過血腦屏障，通過抗炎、抗凋亡等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有效保護(hù)腦缺血等損傷。

本課題通過構(gòu)建脾切除術(shù)后POCD老年大鼠模型觀察黃芩苷能否模型大鼠的認(rèn)知功能，觀察大鼠炎癥因子的水平及海馬NR2B的表達(dá)，探討黃芩苷保護(hù)術(shù)后認(rèn)識功能的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：黃芩苷（上海金穗生物科技有限公司）；10%水合氯醛溶液（Wabcan，ST1002）；RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（TOYOBO，日本）；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml002095、ml037361和ml002293)等；主要儀器：熒光定量PCR儀（Steponeplus公司，德國）；Y形迷宮測試儀（深圳瑞沃德公司）；SPECTRA max Plus 384酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

12月齡雄性老年SD大鼠60只（上海斯萊克動物中心提供），飼養(yǎng)于SPF實(shí)驗(yàn)條件下。對大鼠進(jìn)行隨機(jī)分為5 組，每組12只（n=12），分別為脾切除手術(shù)組（OP group）、假手術(shù)組（Sham group）、黃芩苷低劑量組（Baicalin A group）、黃芩苷中劑量組（Baicalin B group）、黃芩苷高劑量組（Baicalin C group）。

1.2.2 藥物處理

Baicalin A、Baicalin B、Baicalin C組的老年大鼠，于術(shù)前一天分別腹腔注射，給予不同濃度（低，中，高）的黃芩苷（Baicalin A：50 mg/kg/d；Baicalin B：100 mg/kg/d；Baicalin C：200 mg/kg/d）；OP、Sham組的老年大鼠，腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.3 建立脾切除模型

Sham組的實(shí)驗(yàn)動物僅進(jìn)行腹腔麻醉，不實(shí)施脾切除手術(shù)；其他組別實(shí)驗(yàn)動物均進(jìn)行脾切除手術(shù)。使用水合氯醛對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行麻醉后，置于手術(shù)操作臺上，取腹部正中切口，游離脾臟，脾蒂雙重結(jié)扎后切除脾臟，確認(rèn)止血完善后縫合腹部。術(shù)后待大鼠麻醉恢復(fù)后放回各自籠中飼養(yǎng)。

1.2.4 Y迷宮檢測動物認(rèn)知功能

于術(shù)前、術(shù)后第1、第3、第7天分別各組大鼠進(jìn)行新異臂實(shí)驗(yàn)，來檢測老年大鼠的空間探索及記憶能力。Y-迷宮共3個臂，各臂夾角為120°，每個臂的尺寸50 cm×11 cm×20 cm（長×寬×高）。頂部中心安裝攝像頭，對大鼠的探索行為進(jìn)行記錄，3個臂被命名為：起始臂（start）、新異臂（novel）和其他臂（other）。訓(xùn)練階段，新異臂被阻擋，大鼠從起始臂放入，讓其在起始臂和其它臂之間自由探索15 min。結(jié)束后使用10%的酒精對三臂進(jìn)行擦拭并吹干，以排除大鼠動物氣味對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。根據(jù)Dellu的報道，本實(shí)驗(yàn)間隔2 min后開始測試階段[9]。擋板被打開，將大鼠放入迷宮起始臂，允許大鼠在3個臂之間自由探索5 min并對其活動進(jìn)行錄像。兩階段均待大鼠走入中心區(qū)（central）后才進(jìn)行錄像及Anymaze 5.1.1軟件分析，主要分析指標(biāo)為計算大鼠在各個臂中的停留時間或穿梭次數(shù)占總探索時間或總穿梭次數(shù)的百分比，這兩個指標(biāo)被用來衡量動物新異性探索行為。

1.2.5 ELISA檢測血清中相關(guān)細(xì)胞因子水平

分別在術(shù)前、術(shù)后第1、第3、第7天，分別靜脈采集各組大鼠血液,分離血清，ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-6各細(xì)胞因子水平。

1.2.6 RNA抽提和RT-qPCR

取大鼠新鮮腦組織剝離海馬部分，保存于-80℃，利用RT-PCR檢測海馬組織中的NR2B。Trizol-離心柱法提取細(xì)胞總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀評估提取的RNA的質(zhì)量，RNA完整性值（RINs）高于8。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，使用TIANGEN SuperReal PreMix Plus（with SYBR Green I）試劑盒及CFX connect Real-Time PCR System（Steponeplus 公司，Germany）進(jìn)行RT-qPCR。采用Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.1分析軟件及2-ΔΔCT方法定量分析擴(kuò)增曲線及溶解曲線。

2 結(jié) 果

2.1 黃芩苷可以改善脾切除老年大鼠空間探索和記憶認(rèn)知功能

2.1.1 術(shù)前各組別老年大鼠的空間探索和記憶認(rèn)知功能無顯著差異

圖a A.術(shù)前測試階段大鼠分別在三臂中停留時間的百分比；B.術(shù)前測試階段大鼠分別在三臂中穿梭的次數(shù)；C.術(shù)前測試階段各個組別的大鼠運(yùn)動軌跡熱點(diǎn)圖。

如圖a所示，在術(shù)前對各組別大鼠進(jìn)行Y迷宮測試。測試階段大鼠在新異臂中的停留時間及在各臂中的穿梭次數(shù)并沒有明顯的差別。

2.1.2 術(shù)后1天各組大鼠行為學(xué)的比較

圖b A.術(shù)后1天測試階段大鼠分別在三臂中停留時間的百分比；B.術(shù)后1天測試階段大鼠分別在三臂中穿梭的次數(shù)； C.術(shù)后1天測試階段各個組別的大鼠運(yùn)動軌跡熱點(diǎn)圖。

如圖b所示，術(shù)后第一天各組大鼠在各臂停留時間的觀察中發(fā)現(xiàn)，Sham組在新臂中停留的時間要明顯高于OP組及各劑量黃岑苷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在起始臂的停留時間中發(fā)現(xiàn)，Sham組大鼠的停留時間要明顯低于其余各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在異臂的觀察中發(fā)現(xiàn)，OP組及中劑量黃岑苷組大鼠的停留時間要高于Sham組，而Sham組及高劑量黃岑苷組的大鼠其停留時間要明顯低于OP組；在穿梭次數(shù)的觀察中則發(fā)現(xiàn)，Sham組大鼠在新臂中的穿梭次數(shù)要明顯高于其余各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Sham組大鼠在起始臂的穿梭次數(shù)要明顯低于其余各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在新異臂的觀察中則發(fā)現(xiàn)除了中劑量黃岑苷組大鼠的穿梭次數(shù)要明顯高于Sham組之外，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其余各組之間無明顯差異。

2.1.3 術(shù)后第3天各組大鼠行為學(xué)的比較

圖c A.術(shù)后3天測試階段大鼠分別在三臂中停留時間的百分比；B.術(shù)后3天測試階段大鼠分別在三臂中穿梭的次數(shù)；C.術(shù)后3天測試階段各個組別的大鼠運(yùn)動軌跡熱點(diǎn)圖。

如圖C所示，術(shù)后第三天的各臂停留時間的觀察中發(fā)現(xiàn)，不同劑量黃岑苷組及OP組大鼠在新臂的探索時間要顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中高劑量黃岑苷組大鼠在新臂中停留的時間要高于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在起始臂的觀察中發(fā)現(xiàn)，除Sham組外，其余各組大鼠在新臂中停留的時間均要高于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在關(guān)于穿梭次數(shù)的觀察中發(fā)現(xiàn)，Sham組及中、高劑量黃岑苷組的大鼠在新臂中的穿梭此時要明顯高于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而OP組及低劑量黃岑苷組的穿梭次數(shù)要明顯低于Sham組；同時OP組及低劑量黃岑苷組大鼠在起始臂的穿梭次數(shù)要明顯高于Sham組、中劑量黃岑苷組以及高劑量黃岑苷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在異臂中，OP組及低劑量黃岑苷組要高于Sham組。

2.1.4 術(shù)后第7天各組大鼠行為學(xué)的比較

圖d A.術(shù)后7天測試階段大鼠分別在三臂中停留時間的百分比；B.術(shù)后7天測試階段大鼠分別在三臂中穿梭的次數(shù)；C.術(shù)后7天測試階段各個組別的大鼠運(yùn)動軌跡熱點(diǎn)圖。

如圖d所示術(shù)后第7天各臂停留時間的觀察中發(fā)現(xiàn)，Sham組、中劑量黃岑苷組以及高劑量黃岑苷組其在新臂中的停留時間要明顯高于OP組及低劑量黃岑苷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各組大鼠在起始臂和異臂中的停留時間要明顯低于停留在新臂的時間；尤其是低劑量黃岑苷組在起始臂中的停留時間要明顯低于OP組及Sham組；而在異臂的觀察中則只有高劑量黃岑苷組大鼠的停留時間要低于OP組，其余無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 不同濃度黃芩苷對于術(shù)后大鼠血清TNF-α，IL-6，IL-1β的影響

2.2.1 不同濃度黃芩苷對術(shù)后大鼠血清TNF-α的影響

如圖所示，在術(shù)前各組大鼠血清中TNF-α的表達(dá)沒有差異。術(shù)后一天各組血清中TNF-α的表達(dá)明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第3天，各組TNF-α的表達(dá)仍顯著高于Sham組，但其中中劑量黃岑苷組及高劑量黃岑苷組的TNF-α要明顯低于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第七天，Sham及不同劑量黃岑苷組中TNF-α的表達(dá)要明顯低于OP組，提示了黃岑苷尤其是中高劑量的黃岑苷可能具有下調(diào)TNF-α表達(dá)的作用。

2.2.2 不同濃度黃芩苷對術(shù)后大鼠血清IL-6的影響

如圖所示，在術(shù)前各組大鼠血清中IL-6的表達(dá)沒有差異。術(shù)后1天各組血清中IL-6的表達(dá)明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第3天，各組TNF-α的表達(dá)仍顯著高于Sham組，不同劑量黃岑苷組中的IL-6相較于OP組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但和Sham組相比仍然升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第七天，OP組及低劑量黃岑苷組的IL-6濃度要明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），中劑量及高劑量黃岑苷組的IL-6濃度要低于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2.3 不同濃度黃芩苷對術(shù)后大鼠血清IL-1β的影響

如圖所示，在術(shù)前各組大鼠血清中IL-1β的表達(dá)沒有差異。術(shù)后第一天，黃岑苷各組的IL-1β濃度要明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但顯著低于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后第三天，各組的IL-1β的濃度和術(shù)后一天相似；術(shù)后第七天，OP組及低劑量黃岑苷組的IL-1β濃度要高于Sham組,而中、高劑量黃岑苷組的IL-1β的濃度則明顯低于OP組。這提示了黃岑苷可能具有降低術(shù)后IL-1β表達(dá)的作用。

2.3 熒光定量PCR檢測大鼠海馬組織中NR2B的mRNA水平

如圖6所示，在術(shù)前的時間點(diǎn)，各組別NR2B的mRNA水平基本一致；在術(shù)后第一天的觀察中發(fā)現(xiàn)：與Sham組相比，各組NR2B mRNA的水平顯著下降，具有統(tǒng)計學(xué)意義；中、高劑量的黃芩苷組中NR2B的水平雖然下降，但是仍要高于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在術(shù)后第三天的觀察結(jié)果與第一天相似；在術(shù)后第七天的觀察中發(fā)現(xiàn)，各組NR2B的水平相較于前兩天的觀察明顯升高，中、高黃芩苷組NR2B的水平要高于OP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而低劑量黃芩苷組的NR2B濃度要低于sham組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖6 熒光定量PCR檢測術(shù)前，術(shù)后1，3，7天各組大鼠海馬組織中NR2B的mRNA水平。

3 討 論

POCD的發(fā)生嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并導(dǎo)致殘疾和死亡的高風(fēng)險[10-11]。隨著人口老齡化的加速，POCD已成為術(shù)后嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的一大問題。而POCD的發(fā)生機(jī)制眾多，其中Cibelli等人認(rèn)為POCD的發(fā)生哈海馬區(qū)炎性物質(zhì)有關(guān)[12]，在他的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠術(shù)后海馬區(qū)微膠質(zhì)細(xì)胞增多，IL-1β表達(dá)水平顯著增高；而在IL-1β受體缺失大鼠腦內(nèi)并沒有發(fā)生。Rosczyk等人[13]發(fā)現(xiàn)老年大鼠術(shù)后海馬組織中IL-1βmRNA水平有明顯增加且，且在術(shù)后認(rèn)知功能檢測中表現(xiàn)出一定的影響。這提示了術(shù)后認(rèn)知功能的損傷與腦內(nèi)的炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。在本研究中，我們通過脾切除術(shù)后老年大鼠模型的建立，通過行為學(xué)檢測大鼠認(rèn)知功能，通過檢測腦內(nèi)炎性因子及NR2BmRNA的表達(dá)，評估黃芩苷是否能夠通過調(diào)節(jié)炎性物質(zhì)的表達(dá)，改善脾切除大鼠術(shù)后的認(rèn)知功能。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中、高濃度黃芩苷可以在一定程度上改善脾摘除手術(shù)后大鼠短期內(nèi)的認(rèn)知功能。其中值得關(guān)注的是，在術(shù)后1天的時間點(diǎn)，高濃度的黃芩苷可以在一定程度上改善大鼠在在Y迷宮中的辨別探索能力和認(rèn)知記憶能力。而在術(shù)后7天，隨著時間推移，認(rèn)知記憶能力的恢復(fù)，各組間大鼠的認(rèn)知功能并沒有明顯差異。

另外，黃芩苷可以在一定程度上減少海馬組織炎性因子的釋放。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以明顯降低TNF-α、IL-6以及IL-1β的表達(dá)，并且對于炎癥因子表達(dá)的抑制呈劑量相關(guān)性。在對于NR2BmRNA的觀察中發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠腦內(nèi)NR2BmRNA濃度急劇下降，黃芩苷可以避免術(shù)后NR2BmRNA在腦內(nèi)的降低。

NR2B作為NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位，是調(diào)節(jié)長時程增強(qiáng)（LTP）現(xiàn)象及突觸可塑性的重要部分，眾多電生理實(shí)驗(yàn)證明NMDA受體能夠介導(dǎo)LTP現(xiàn)象及調(diào)節(jié)突觸可塑性過程[14-15]。中、高劑量黃芩苷處理組的老年大鼠在術(shù)后第1天和第3天NR2B水平開始有逐步恢復(fù)，術(shù)后第7天幾乎恢復(fù)至正常水平，這提示我們黃芩苷處理能夠提高NR2B轉(zhuǎn)錄及翻譯合成水平，而黃芩苷抑制炎癥因子的機(jī)制可能和NR2BmRNA的作用有關(guān)。

綜上，黃芩苷可以通過降低術(shù)后炎癥因子如TNF-α，IL-6，IL-1β的表達(dá)，并提高NR2B轉(zhuǎn)錄及翻譯合成水平，從而改善POCD模型大鼠的術(shù)后認(rèn)知功能障礙。