利用同源重組構(gòu)建Chordin、BMP6 真核表達(dá)載體及共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞表達(dá)的研究

榮 恒，李 晶，柳 楠，張夢(mèng)瑤，賀建寧*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，山東濟(jì)寧 273100）

隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)羊毛的需求量不斷增加，對(duì)羊毛產(chǎn)量、質(zhì)量的研究顯得尤為重要[1]。羊毛是毛囊的衍生物，羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量取決于毛囊的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)[2]。與要控制羊毛的性狀發(fā)育特征，更取決于對(duì)毛囊發(fā)育規(guī)律和結(jié)構(gòu)特征的研究[3]。敖漢細(xì)毛羊作為我國(guó)極具代表性的細(xì)毛羊品種之一[4]，大多數(shù)關(guān)于敖漢細(xì)毛羊羊毛的研究都集中在分子水平上探究羊毛性狀形成的機(jī)理[5]和羊毛的生長(zhǎng)部位[6]，而在細(xì)胞水平上探索毛囊生長(zhǎng)相關(guān)的基因也非常重要。

Chordin在腹原軸形成和原腸胚形成期間誘導(dǎo)神經(jīng)組織，也在維持和分化中起主要作用[7]。據(jù)報(bào)道，Chordin是細(xì)胞外BMP 拮抗劑，以其高親和力與BMP-2/4 結(jié)合，進(jìn)一步干擾與BMP 受體的結(jié)合[8]。Chordin作為BMPs 的分泌拮抗劑，在細(xì)胞外空間中對(duì)BMPs 的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。Chordin基因與BMP 基因家族結(jié)合并阻止Chordin與其受體相互作用進(jìn)而影響B(tài)MPs 的表達(dá)傳遞[9]。BMPs 作為毛囊發(fā)育的抑制信號(hào)分子[10]，Chordin可阻止其傳導(dǎo)途徑，間接體現(xiàn)出對(duì)毛囊發(fā)育的促進(jìn)作用。

目前，關(guān)于Chordin和BMP6基因?qū)?xì)毛羊毛囊的影響基本明確，但只是基于分子層面，且Chordin和BMP6基因的相互作用尚未清晰。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將Chordin、BMP6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后在細(xì)胞水平上驗(yàn)證兩基因間的相互作用，為進(jìn)一步的分子育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取40 日齡的健康胎羊（由青島奧特種羊場(chǎng)提供）并及時(shí)消毒處理。

TRIZol（Roche）試劑、蛋白裂解液、EcoRI 限制性?xún)?nèi)切酶、KpnI 限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、pcDNA3.1 質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DMEM（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、胰蛋白酶、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、DPBS（磷酸緩沖鹽溶液）、Lipofectamine 2 000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SoSo試劑盒、切膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、培養(yǎng)皿等均購(gòu)自青島尚賽科貿(mào)有限公司[11]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 從組織中提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在綿羊Chordin和BMP6基因序列（GenBank登錄號(hào)分別為XM-027957560.1 和XM_027958445.1）CDS 區(qū)外側(cè)通過(guò)Primer5.0 設(shè)計(jì)引物，并在上游引物和下游引物的5'加入同源臂。Chordin基因完成后的引物序列上游引物：5'-TTTAAACTTAAGCTCGGAATTC CCCCAGCTGTCCCGTTCG-3'；下游引物：5'-TGGATC CGAGCTCGGCTAGGAGCCTTCATCTTCTTTCCCAG AC-3'。BMP6基因完成后的引物序列上游引物：5'-TT TAAACTTAAGCTTGGTACCATGATTCCTGGTAACC GAATGCTG-3'；下游引物：5'-TGGATCCGAGCTCGG TACCTCAGCGGCACCCACATCCCTCCACTA-3′。

通過(guò)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，體系均為25 μL：DNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，金牌Mix 22 μL。

1.2.2Chordin、BMP6基因與pcDNA3.1 質(zhì)粒同源重組對(duì)pcDNA3.1 質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI、KpnI 單酶切，酶切體系：EcoRI 1 μL，KpnI 1 μL；pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，補(bǔ)水至50 μL；置于37℃金屬浴中2 h。電泳檢測(cè)后，通過(guò)切膠回收試劑盒純化Chordin、BMP6基因及切開(kāi)的pcDNA3.1，通過(guò)T4DNA 連接酶將Chordin、BMP6基因與pcDNA3.1 分別進(jìn)行連接，體系：Chordin、BMP6基因各1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL；置于50℃金屬浴10 min。之后轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取搖菌后的單菌落對(duì)其進(jìn)行陽(yáng)性率測(cè)定，經(jīng)測(cè)序、質(zhì)粒提取最終獲得陽(yáng)性質(zhì)粒[11]。

1.2.3 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 用75%酒精浸洗2 遍從羊場(chǎng)取回的40 日齡胎羊成之后，在培養(yǎng)皿中用75%酒精再次清洗3 遍，最后用含有雙抗的PBS 反復(fù)清洗3 遍。之后用剪刀剪掉頭部和四肢，然后將軀干剪成1.5 mm3左右，將其放在培養(yǎng)皿，加胎牛血清，在細(xì)胞培養(yǎng)箱CO2為5%、溫度37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，再加培養(yǎng)液。從培養(yǎng)箱拿出24 h 后，用PBS 沖洗干凈，更換培養(yǎng)液，定時(shí)觀察。細(xì)胞生長(zhǎng)到95%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)[11]。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在傳代后2 代進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Lipofecta mine 2 000 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，單、共轉(zhuǎn)染組分別加20 μL脂質(zhì)體試劑和480 μL DMEM（不含雙抗），混勻，靜置10 min。在共轉(zhuǎn)染組中加入20 μL 構(gòu)建好的表達(dá)載體和460 μL DMEM，對(duì)照組加入20 μL 構(gòu)建好的表達(dá)載體和480 μL DMEM，靜置20 min，然后將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組都移到培養(yǎng)皿中均加入4 mL DMEM，在37℃條件下，培養(yǎng)6 h 后換液，培養(yǎng)36 h[11]。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的RT-PCR 擴(kuò)大培養(yǎng)轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞 細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部長(zhǎng)到95%時(shí)，每個(gè)板加TRIZol（Roche）試劑3 mL，細(xì)胞裂解后進(jìn)行RNA 提取。RNA提取完成后，測(cè)定濃度和純度符合標(biāo)準(zhǔn)后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA[17]。通過(guò)PrimerPremier5.0 軟件設(shè)計(jì)Chordin、BMP6和GAPDH基因的引物序列（表1）。

表1 引物信息

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)測(cè)定表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各3 次重復(fù)，Chordin相對(duì)于內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量用Ct（2-ΔΔCt）值法計(jì)算。利用SPSS 17.0 中t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[12]。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Western Blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 利用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）將樣品分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每個(gè)組3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。先裂解提取細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，內(nèi)參基因GAPDH、單轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染組分別點(diǎn)3 個(gè)膠孔，電泳后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行PVDF 轉(zhuǎn)膜，用轉(zhuǎn)膜電泳槽進(jìn)行2～3 h，之后封閉蛋白質(zhì)2 h；TBST 洗膜3 次，每次5 min；以1:2 000 的比例對(duì)一抗進(jìn)行稀釋?zhuān)?℃冰箱用一抗孵育PVDF 膜12 h；用TBST 洗膜3 次,每次5 min。以1:2 000 的比例稀釋二抗，孵育1.5 h；在暗室中曝光。用ImageJ 軟件分析條帶，結(jié)果用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增 圖1 為凝膠電泳分析結(jié)果（2% 瓊脂糖凝膠），擴(kuò)增條帶分別位于2 874 bp 和537 bp 處，分別為Chordin和BMP6基因，與已知一致。

2.2 pcDNA3.1 載體單酶切及純化 利用EcoRI、KpnI酶對(duì)pcDNA3.1 單酶切，EcoRI、KpnI 酶切效果良好，pcDNA3.1 載體5 428 bp，可用于后期的實(shí)驗(yàn)（圖2）。

2.3 表達(dá)載體pcDNA3.1 與目的片段重組及鑒定 通過(guò)膠回收獲得純凈Chordin、BMP6基因片段和pcDNA3.1，利用SoSo 試劑盒分別將其連接。之后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，37℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。對(duì)菌液進(jìn)行PCR 電泳鑒定結(jié)果顯示（圖3），在2 874 bp 和537 bp 處各有單一明亮條帶，為Chordin、BMP6基因。菌液測(cè)序后用BLAST 比對(duì)，堿基均未發(fā)生突變，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。提取重組質(zhì)粒，如圖4 所示，pcDNA3.1-BMP6、pcDNA3.1-Choedin 重組后質(zhì)粒大小分別為5 965、8 302 bp，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 每天定時(shí)用電子倒置顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，記錄成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)的形狀變化（圖5）。24 h 后細(xì)胞逐漸貼壁，并有些許細(xì)胞從組織塊中游離出來(lái)，其呈梭形、圓形。待密度達(dá)到90%進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞仍為梭形。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)mRNA 的表達(dá) 從轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞中提取RNA，之后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，利用上、下游引物對(duì)目的基因Chordin、BMP6和內(nèi)參基因GAPDH片段同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖6）表明，擴(kuò)增的條帶單一明亮，GAPDH產(chǎn)物大小為125 bp、Chordin產(chǎn)物大小為127 bp、BMP6產(chǎn)物大小為112 bp，與已知大小均相同，可繼續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。

目的基因Chordin、BMP6和內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線、熔解曲線如圖7 所示，曲線清晰且只有1 個(gè)峰值，表明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 過(guò)程中無(wú)二聚體且得到了特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，可用來(lái)進(jìn)行定量分析。利用SPSS 對(duì)兩組mRNA 的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定和分析，經(jīng)共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，Chordin基因的表達(dá)量極顯著提高，BMP6基因的表達(dá)量顯著降低（圖8）。

2.6 Westren Blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá) 以成纖維細(xì)胞提取的蛋白為模板進(jìn)行Western Blot。如圖9 顯示，共轉(zhuǎn)染組的條帶明顯粗于單轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，由Image J 軟件分析灰度值，灰度值用SPSS 分析。由圖10 可知，共轉(zhuǎn)染組Chordin基因蛋白的表達(dá)高于單轉(zhuǎn)染組（P＜0.01），共轉(zhuǎn)染組BMP6基因蛋白的表達(dá)低于單轉(zhuǎn)染組（P＜0.01）。

3 討 論

許多研究表明，毛囊的發(fā)育依靠一系列的信號(hào)分子，這些信號(hào)分子在真皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間穿梭著，介導(dǎo)了這2 個(gè)細(xì)胞群體間的相互作用，從而促使毛囊的形成[13]。目前，調(diào)節(jié)毛囊形態(tài)發(fā)生的信號(hào)分子主要分為Wnt 通路、TNF 家族、FGF 家族、BMP 家族、Shh 通路、TGF 家族和NOTCH 通路七類(lèi)[14]。這些信號(hào)分子之間都會(huì)相互作用調(diào)控，有的是毛囊發(fā)育的促進(jìn)物，有的是抑制物。BMP6屬于BMP 家族中的一員，此家族中的基因基本上都抑制毛囊的發(fā)育。Meephansan 等[15]研究表明，BMP4基因在絨山羊毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的退行期表達(dá)量最高，隨著進(jìn)入生長(zhǎng)期其表達(dá)量逐漸降低，其表達(dá)量隨著毛囊的周期性變化而變化。Botchkarev 等[16]于2001 年發(fā)現(xiàn)Noggin基因可以間接促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)，其作用機(jī)制抑制了BMP4基因的活性。Chordin基因也可作為BMPs 類(lèi)的拮抗劑。有研究表明，Chordin基因在背軸形成中起到了重要的作用，是背軸形成的組件之一。來(lái)自組織的Chordin分泌作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）的拮抗劑，從而調(diào)節(jié)其在爪蟾中的活性。Chordin在背側(cè)保持低BMP 活性水平，誘導(dǎo)背部組織形成，如神經(jīng)外胚層。

之前的研究表明，Chordin對(duì)毛囊的發(fā)育起到了一定促進(jìn)作用，而B(niǎo)MP6基因?qū)γ业陌l(fā)育起到了一定的抑制作用。但2 個(gè)基因間的作用機(jī)制還尚未清晰。因此，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)將BMP6基因和Chordin的過(guò)表達(dá)載體單、共轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞后測(cè)定其表達(dá)量的變化。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)pcDNA3.1-Chordin、pcDNA3.1-BMP6載體的構(gòu)建，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot 技術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后的表達(dá)量，證實(shí)共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后Chordin基因的表達(dá)量明顯升高且共轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量極顯著高于單轉(zhuǎn)染組，BMP6基因的表達(dá)量明顯下降，且共轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量極顯著低于單轉(zhuǎn)染組，Chordin基因抑制了BMP6基因的表達(dá)，BMP6基因促進(jìn)了Chordin基因的表達(dá)，進(jìn)而確定2 個(gè)基因間的作用關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)可作為之前研究作補(bǔ)充，為進(jìn)一步的分子育種工作提供依據(jù)。