組蛋白去乙?；敢种苿εＱ蝮w細胞核移植影響的研究進展

李 颯，房曉歡，張效生，張金龍，孫樹春,3*，李俊杰,3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定 071000；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；3.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心，河北保定 071000）

體細胞核移植（SCNT）是一項重要的動物細胞工程技術，可應用于轉(zhuǎn)基因動物制備、疾病模型構(gòu)建、動物遺傳多樣性保存及瀕危哺乳動物繁殖等多種領域，但SCNT 效率較低，僅為1%～5%，阻礙了該技術的廣泛應用[1]。目前認為供體細胞或重構(gòu)胚重編程不完全與克隆動物成功率低存在密切聯(lián)系[2]。組蛋白乙?；潜碛^遺傳重編程的重要調(diào)節(jié)機制之一，與克隆胚胎的發(fā)育密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，SCNT 胚胎中組蛋白乙?；狡毡檩^低，提高組蛋白乙?；娇商岣咧鼐幊绦蔥3]。近年來，有關組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）對供體細胞重編程和SCNT 胚胎發(fā)育的促進作用得到越來越多證實。在對牛羊供體細胞的影響方面，Cao等[4]研究發(fā)現(xiàn)HDACi 處理羊供體細胞使G0/G1 期細胞所占比例上升，有利于SCNT 胚胎發(fā)育，并可提高H4K12、H3K9 乙?；剑籐i 等[5]研究發(fā)現(xiàn)HDACi處理牛供體細胞后，可影響組蛋白甲基化H3K4me3、H3K9me2 位點的表達，促進克隆胚胎發(fā)育；在重構(gòu)胚方面，眾多研究表明HDACi 對重構(gòu)胚的早期發(fā)育、表觀遺傳修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及多能基因表達、細胞凋亡等方面有重要影響[6-8]。本文主要針對HDACi 對牛羊SCNT 的影響進行綜述，為提高牛羊的體細胞克隆胚胎生產(chǎn)效率提供參考。

1 HDACi 的作用及分類

HDACi 是一類蛋白酶抑制劑，通過干擾組蛋白去乙酰化酶（HDACs）的功能從而在染色體重塑、基因的表達調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。目前HDACi 在治療癌癥和許多其他疾病以及提高克隆胚胎的重編程效率上得到廣泛研究。HDACi 按結(jié)構(gòu)可分為五大類：①異羥肟酸類，代表藥物有曲古抑菌素A（TSA）、Scriptaid（SCR）、伏立諾他（SAHA）、CBHA；②短鏈脂肪酸類，如丙戊酸（VPA）、丁酸鈉（SB）；③苯甲酰胺類，如西達本胺；④環(huán)狀四肽類，如天然產(chǎn)物縮酚酸肽FK-228；⑤Sirt 抑制劑，如Sirtinol 和Salermide。受HDACi 種類、處理濃度及作用時間的影響，作用效果會產(chǎn)生很大差異，因此高效HDACi 的發(fā)現(xiàn)和處理條件的優(yōu)化非常關鍵[8-9]。在牛羊SCNT 上應用的HDACi主要為VPA、TSA、SCR、CBHA 及SAHA。

2 HDACi 對牛羊供體細胞的影響

2.1 HDACi 對供體細胞周期的影響 供體細胞的細胞周期對體細胞克隆的成敗至關重要。S 期的細胞染色體為非整倍性，處于DNA 合成期，使用S 期細胞作為供體細胞進行核移植得到的胚胎常常為畸形，因此S 期細胞不宜用于體細胞克隆，而是將處于G0/G1 期的細胞作為供體[10]。研究顯示，對供體細胞進行饑餓處理或誘導處理使細胞至G0/G1 期，核移植效率明顯高于未處理的供體細胞[11]。高海霞等[12]用0.8、1.0、2.0 mmol/L VPA 處理牛供體細胞24、48、72 h 后，發(fā)現(xiàn)G0/G1 期細胞極顯著增加，S 期和G2/M 期細胞極顯著減少，并具有明顯的時間和劑量依賴性，隨處理時間或劑量的增加G0/G1 期細胞比例增加。有研究表明，50 nmol/L TSA 處理牛供體細胞24 h 后，與VPA 的作用效果相似，可使牛供體細胞處于G0/G1 期[13]。Cao 等[4]使用0.2 μmol/L SCR 處理羊供體細胞24 h 使G0/G1 期細胞所占比例升高，促進了體細胞克隆胚胎的發(fā)育。因此，HDACi 可通過調(diào)節(jié)供體細胞周期提高克隆效率。

2.2 HDACi 對供體細胞組蛋白乙?；降挠绊?組蛋白乙酰化/去乙?；怯山M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HATs）和HDACs 共同催化完成，HATs 與HDACs 之間的動態(tài)平衡可調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。HDACi 主要通過干擾HDACs 的活性發(fā)揮作用。Luo 等[8]研究表明，用0.15～0.6 μmol/L TSA 處理牛供體細胞48 h 后，主要影響HDAC1的表達，對供體細胞中HAT1的表達無影響；Selokar 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當2.5～10 mmol/L VPA 處理牛供體細胞24 h 后，HDAC1表達下降，而對HDAC2的表達無影響；使用16 μmol/L SAHA 處理羊脂肪間充質(zhì)干細胞24 h 發(fā)現(xiàn)，SAHA 能顯著提高HDAC1和HDAC6的表達，降低SIRT1的表達[15]。

當HDACs 活性受到抑制，HATs 將乙酰輔酶A 的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白氨基端特定的賴氨酸殘基上，使組蛋白發(fā)生乙?；?。阮秋燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)，0.25、0.5、0.75 μmol/L SCR 處理水牛胎兒成纖維細胞24 h 后可使其acH4K18 顯著提高；而Cao 等[4]用0.2 μmol/L SCR處理綿羊卵丘細胞24 h 作用于H4K12、H3K9 位點，提高了卵丘細胞acH4K12、acH3K9 水平；Agrawal 等[6]用2.5～20 μmol/L CBHA 處理牛供體細胞24 h 后可提高acH3K9 水平，但不影響acH3K27 水平。同樣，16 μmol/L SAHA 處理阿爾巴白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細胞24 h，也可提高acH3K9 水平，影響SCNT 胚胎發(fā)育[17]。因此，HDACi 能促進供體細胞不同組蛋白位點呈現(xiàn)高水平的乙?；癄顟B(tài)，有助于核移植后重編程，促進胚胎發(fā)育。

2.3 HDACi 對供體細胞組蛋白甲基化水平的影響 組蛋白甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾方式，發(fā)生于精氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化，可誘導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。組蛋白甲基化修飾包括組蛋白一甲基化修飾（me1）、二甲基化修飾（me2）和三甲基化修飾（me3），其中，H3K9 的二甲基化和三甲基化修飾可影響基因沉默，H3K4 的甲基化修飾與基因轉(zhuǎn)錄起始有關。研究證明使用0.1 μmol/L TSA和0.5 μmol/L SCR分別處理牛供體細胞14 h，可使H3K9me3 水平顯著降低，但不影響H3K9me2 的表達水平[18]。Li 等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)0.25～1.0 mmol/L VPA處理牛成纖維細胞24 h后，其供體細胞H3K4me3 水平隨VPA 處理濃度的增加而提高，H3K9me2 水平則隨VPA 濃度的增加顯著降低，有助于基因的表達與轉(zhuǎn)錄。可見，HDACi 可通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化水平調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)，提高SCNT 效率。

3 HDACi 對SCNT 胚胎早期發(fā)育的影響

3.1 HDACi 處理供體細胞對SCNT 胚胎早期發(fā)育的影響 利用HDACi 處理供體細胞后對SCNT 胚胎早期發(fā)育進行研究，Luo 等[8]發(fā)現(xiàn)用0.15、0.3 μmol/L TSA 處理牛供體細胞48 h 可使SCNT 胚胎的卵裂率和囊胚率顯著提高；李俊杰等[19]用0.4 μmol/L TSA 處理山羊卵丘細胞19 h 后得到相同結(jié)果。但TSA 本身有致畸作用，高濃度TSA 處理供體細胞或作用時間過長都將顯著降低核移植胚胎的體外發(fā)育能力[9]。SCR 毒性較TSA 低，且具有較高的組蛋白乙酰化活性。Cao 等[4]用0.2 μmol/L SCR 處理羊卵丘細胞24 h，顯著提高了SCNT 胚胎的囊胚率。Sangalli 等[20]用0.2 mmol/L VPA 處理牛成纖維細胞24 h 后，重構(gòu)胚組蛋白乙?；?、囊胚率均未提高，克隆牛胚胎植入前和植入后的發(fā)育情況也未改善。Selokar 等[21]雖證實1.5、3.0、4.5 mmol/L VPA 處理24 h 可改變水牛供體細胞組蛋白乙酰化和基因表達，但未改善克隆胚胎的體外發(fā)育能力，推測此結(jié)果的產(chǎn)生與供體細胞來源有關?？傊?，不同HDACi 處理供體細胞對于提高SCNT 效率和胚胎品質(zhì)的作用不同。

3.2 HDACi 處理重構(gòu)胚對SCNT 胚胎早期發(fā)育的影響當用3 mmol/L VPA 處理牛重構(gòu)胚24 h 時，效果顯著，可增加其囊胚率，大大提高牛囊胚形成速度、內(nèi)胚層和滋養(yǎng)層的細胞數(shù)量、細胞存活率，并顯著降低囊胚細胞凋亡[7]。Wen 等[22]用TSA 和SCR 處理羊重構(gòu)胚24 h，對比對照組的克隆效率發(fā)現(xiàn)0.2 μmol/L SCR 的囊胚發(fā)育率較高，幾乎是未處理組的2 倍，且0.2 μmol/L SCR比0.05 μmol/L TSA 對提高體外克隆綿羊胚胎的囊胚率更有效。曹慧等[23]用0.1 μmol/L TSA 和0.4 μmol/L SCR處理牛重構(gòu)胚12 h，均可顯著提高囊胚率，同樣，SCR處理效果優(yōu)于TSA。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，分別使用0.02 μmol/L和0.2 μmol/L的TSA和SCR處理牛孤雄胚胎15 h，可顯著提高其桑椹胚率和囊胚率。Agrawal 等[25]用10 μmol/L CBHA 處理牛重構(gòu)胚10 h，囊胚率明顯提高，囊胚凋亡指數(shù)降低，提高了SCNT 效率?？傊琀DACi 有利于SCNT 胚胎的早期發(fā)育，可用于提高其體外生產(chǎn)效率。

4 HDACi 提高SCNT 早期發(fā)育的機制

4.1 HDACi 對重構(gòu)胚表觀遺傳修飾的影響 表觀遺傳修飾主要發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期階段，并與其發(fā)育潛能有關，因此這些表觀遺傳標記可用來預測SCNT 效率。Luo 等[8]研究表明，0.3 μmol/L TSA 處理牛供體細胞48 h 后提高了重構(gòu)胚八細胞階段H4K8 的乙?；_到與體外受精（IVF）胚胎同階段相似水平。而Selokar等[14]使用2.5～10 mmol/L VPA處理牛供體細胞24 h后，其克隆囊胚中H3K9me3 水平顯著低于未經(jīng)處理的克隆胚胎，并使表觀遺傳狀態(tài)更接近IVF 胚胎。Cao 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 μmol/L SCR 處理羊供體細胞24 h 后，SCNT 胚胎中acH4K12 水平顯著提高。Wen 等[22]使用0.2 μmol/L SCR 處理羊重構(gòu)胚24 h 后發(fā)現(xiàn)，重構(gòu)胚中除acH4K12 外，acH3K9 水平也有顯著提高。因此，HDACi 在一定程度上對SCNT 胚胎的表觀遺傳重編程異常有修復作用，可使SCNT 胚胎的表觀遺傳修飾水平更接近IVF 胚胎。

4.2 HDACi 對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及重構(gòu)胚多潛能基因表達的影響 HDACi 促進組蛋白乙?；g接導致染色質(zhì)構(gòu)型的改變，染色質(zhì)重塑對基因表達十分重要，疏松型染色質(zhì)可以促進基因的表達。Tóth 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TSA 可以誘導間期染色質(zhì)發(fā)生去凝縮作用，使染色質(zhì)長度從200 nm 延伸到1 μm。Li 等[27]通過基因表達間接觀察TSA 對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的構(gòu)型發(fā)生改變，由緊密型變?yōu)槭杷尚汀?/p>

多潛能基因OCT4、NANOG、CDX2和SOX2是哺乳動物早期胚胎中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育早期起關鍵作用。研究表明，使用0.5 mmol/L VPA 處理重構(gòu)胚24 h 可過表達OCT4和NANOG[5]；用10 μmol/L CBHA 處理牛克隆胚胎10 h 后也可促進OCT4和NANOG的表達[25]。Iager 等[28]使用50 nmol/L TSA 處理牛重構(gòu)胚13 h 后，NANOG和CDX2表達量顯著上調(diào)，且高于IVF 胚胎。魏麗曉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 μmol/L SAHA處理山羊胎兒成纖維細胞24 h 后，克隆胚胎中囊胚的OCT4、SOX2、NANOG表達水平均顯著高于未處理囊胚。因此，HDACi 能使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑并對多潛能基因的表達有顯著影響。

4.3 HDACi 對重構(gòu)胚凋亡的影響 SCNT 胚胎細胞凋亡是影響胚胎質(zhì)量的關鍵因素。研究表明用2.5～10 mmol/L VPA 處理牛供體細胞24 h 后可抑制牛SCNT 囊胚細胞的凋亡，提高囊胚質(zhì)量[14]。Cui 等[30]研究發(fā)現(xiàn)0.05 μmol/L TSA 處理牛重構(gòu)胚10 h 后可調(diào)節(jié)凋亡相關基因表達，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-xL表達，下調(diào)促凋亡基因Bax表達。并且，TSA 處理可影響重構(gòu)胚中miRNA 的表達，SCNT 胚胎中miRNA-21 表達量低于IVF 胚胎，而TSA 處理可使其表達量增加，增強細胞的抗凋亡能力，從而促進?？寺∨咛サ陌l(fā)育[30]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。ERS 過強或持續(xù)時間過長會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)嚴重失衡，無法修復，引起細胞凋亡。Song 等[7]研究發(fā)現(xiàn)在衣霉素誘導的ERS 條件下，使用3 mmol/L VPA 處理牛重構(gòu)胚24 h 可顯著降低SCNT 胚胎ERS 相關信號分子sXBP-1和CHOP的轉(zhuǎn)錄水平，并顯著提高抗凋亡蛋白GRP78/BiP 的表達水平，保護細胞免受ERS 介導的細胞凋亡影響?？梢?，HDACi 處理可抑制細胞凋亡，促進胚胎的進一步發(fā)育。

5 總結(jié)及展望

HDACi 作為一類組蛋白去乙?；敢种苿诳寺∨咛サ谋碛^遺傳改變及發(fā)育方面具有積極作用。但由于HDACi 種類繁多及處理效果受時間、濃度等多因素影響，因此開發(fā)高效HDACi 和優(yōu)化處理條件，對提高重編程效率、促進胚胎發(fā)育至關重要。此外，HDACi的作用機制及克隆胚胎移植后出生胎兒能否正常生長、發(fā)育仍需要進一步探討。