層粘連蛋白對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響

李春霞，朱菲菲，張俊星，張林林，李 新，郭益文，郭 宏，丁向彬

（天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

骼肌作為動物機體的重要組成部分，它的生長發(fā)育是生物學(xué)研究的重要內(nèi)容[1]。當(dāng)骨骼肌生長和再生需要時，干細(xì)胞（骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞）就會被激活，然后開始增殖和分化形成肌纖維，從而形成肌肉組織[2]。而肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化是基因選擇性表達的結(jié)果[3]。研究表明，通過檢測Pax7和MyHC基因的表達變化可以鑒定成肌細(xì)胞的增殖分化狀態(tài)[4]。細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）作為組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支持物，可影響細(xì)胞的形態(tài)，調(diào)控細(xì)胞的正常代謝，如遷移、增殖、分化以及信息傳遞等[5]。許多研究證明，不同的ECM 成分會影響培養(yǎng)細(xì)胞不同的行為特性[6]。層粘連蛋白（Laminin，LN）是ECM 主要的蛋白組成成分，它與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為相關(guān)[7]。在2010 年，趙曉芳等[8]就發(fā)現(xiàn)LN 具有增強細(xì)胞間黏附的作用。現(xiàn)已證明，LN 通過與細(xì)胞間的相互作用可直接或間接控制細(xì)胞的活動，如黏附或轉(zhuǎn)移、增殖或分化、凋亡或基因表達[9]。例如，LN 能刺激腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，可使沒有脫落的腫瘤細(xì)胞黏附性增強，已脫落的腫瘤細(xì)胞促進其轉(zhuǎn)移，因此可反映腫瘤的生成、浸潤、生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后[10]；LN 可抑制成纖維細(xì)胞增殖，但可促進肝細(xì)胞增殖。重要的是，LN 與先天性肌營養(yǎng)不良相關(guān)，LN 的α2 鏈缺失可導(dǎo)致早期進行性肌營養(yǎng)不良[11]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉肌源性分化和肌損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用[12]。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和成肌分化過程受多種因素調(diào)控，外源性ECM 對于體外培養(yǎng)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞影響的研究還比較少[13]。本實驗旨在通過在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中外源性涂層LN，觀察和分析牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化情況，從而為肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化及利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 37℃、50% CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；Light Cycle 96 熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）；熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；超敏電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司）；低溫高速離心機 Centrifuge 5810R（德國 Eppendorf 公司）；蛋白電泳儀Mini-PROTEAN Tera System（Bio-Rad）等。

1.2 試驗材料 LN（美國Sigma 公司）；胎牛血清 FBS、馬血清 HS、Opti-DMEM（美國Gibco 公司）；PBS 溶液（北京索萊寶公司）；EASYspin Plus 組織/細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技公司）；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（北京TaKaRa 公司）；定量Mix（廣州復(fù)能公司）；qRT-PCR 檢測相關(guān)引物（蘇州金唯智生物科技公司）；RIPA 裂解液、電泳液、電轉(zhuǎn)液、發(fā)光液和TBS（北京索萊寶公司）；蛋白酶抑制劑PMSF（美國SIGMA 公司）；BCA 試劑盒（北京康為公司）；Pax7、MyoG、MyHC 一抗（DSHB 公司）；MyOD 一抗（上海生工生物工程公司）；GAPDH 一抗、羊抗鼠和羊抗兔二抗（北京中杉金橋公司）等。

1.3 主要試劑的配制 1 mg/mL LN 用30 mL 的1×PBS緩沖溶液稀釋至33.3 μg/mL，-20℃放置。復(fù)蘇培養(yǎng)基：20% G-FBS（胎牛血清）+80% DMEM+1% S K；增殖培養(yǎng)基：20% G-FBS+80% DMEM；分化培養(yǎng)基：2%G-HS（馬血清）+98% DMEM；蛋白裂解液：RIPA 與PMSF 按100:1 的體積比例配制；變性蛋白樣品：按 3:1體積比例混勻 4×蛋白上樣緩沖液和蛋白樣品。

1.4 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離和純化 屠宰場采集健康的5 月齡牛胎兒，將其后肢肌肉用眼科剪充分剪碎，用5 mL 0.2%膠原酶Ⅱ在37℃水浴鍋中消化1 h，0.25%胰酶消化30 min，將上述混合液依次過100、200、400 目細(xì)胞篩，離心收集細(xì)胞后用含有20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸，接種到培養(yǎng)皿中，采用差速貼壁法對分離的細(xì)胞進行純化，后進行增殖培養(yǎng)。采用含有2% HS 的DMEM 培養(yǎng)基進行體外誘導(dǎo)分化，建立牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外誘導(dǎo)成肌分化模型。分離、純化后的細(xì)胞為本實驗所用的原代牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，液氮凍存以便后期實驗所用。具體步驟參照課題組前期已建立的實驗方法[14]。

1.5 LN 鋪板方法 提前將-20℃保存的LN 溶液放到4℃緩慢溶解。溶解后，在傳代3～4 h 前開始鋪板，用于裂解RNA 的24 孔板、裂解蛋白的6 孔板和用于EdU細(xì)胞增殖檢測實驗的96 孔板，實驗組每孔分別鋪有180、400、50 μL 的LN 溶液，對照組均鋪有等體積的1×PBS 緩沖溶液，然后置于37℃、50% CO2恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h，吸棄涂層溶液，用1×PBS 清洗3 次，并將所有培養(yǎng)皿表面風(fēng)干。

1.6 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 復(fù)蘇本實驗室前期分離純化的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞于37℃、50% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d，待細(xì)胞生長密度達到80%～90%時吸棄復(fù)蘇所用的培養(yǎng)基，1×PBS 清洗1次，使用增殖培養(yǎng)基將細(xì)胞傳代至提前涂好LN（實驗組）和PBS（對照組）的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。用于檢測mRNA 水平表達情況的細(xì)胞接種至24 孔板，用于檢測蛋白水平表達情況的細(xì)胞接種至6 孔板，用于檢測增殖期EdU 陽性細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞接種至96 孔板。本實驗共檢測4 個時期：從傳代即刻至細(xì)胞在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至12 h 時為增殖12 h、培養(yǎng)至24 h 為增殖24 h，收集細(xì)胞 RNA、蛋白進行下游實驗；當(dāng)細(xì)胞生長融合度達到80%～90%時進行 EdU 實驗；待細(xì)胞增殖培養(yǎng)至生長密度為80%～90%時更換分化培養(yǎng)基，于更換分化培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h為分化24 h、培養(yǎng)至48 h為分化48 h，收集細(xì)胞 RNA、蛋白進行下游實驗。

1.7 EdU 細(xì)胞增殖檢測 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代后接種于96 孔板（已做涂層處理），加入100 μL 50 μmol/L的EdU 培養(yǎng)基，37℃孵育2 h，PBS 清洗細(xì)胞2～3 次，加入50 μL的細(xì)胞固定液固定30 min，加入50 μL 2 mg/mL的甘氨酸，脫色5 min 后用PBS 清洗細(xì)胞2 次，然后加入100 μL 的1×Apollo?染色反應(yīng)液，避光室溫孵育30 min，棄反應(yīng)液，加入100 μL 甲醛清洗5 min，用PBS 清洗2 次。加入100 μL 的DAPI 反應(yīng)液，避光，室溫孵育30 min，PBS 清洗2 次，最后一次PBS 保留。熒光顯微鏡下檢測EdU 陽性細(xì)胞數(shù)，每個生物學(xué)重復(fù)采集3 個視野，增殖率根據(jù)EdU 陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計計算，EdU 統(tǒng)計結(jié)果用EdU 標(biāo)記指數(shù)（%）表示。

1.8 qRT-PCR 檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化期mRNA 表達水平 于培養(yǎng)箱中取出24 孔板，用預(yù)熱的無酶PBS 清洗細(xì)胞2 次，加入600 μL RNA 細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，利用細(xì)胞RNA 高效提取試劑盒提取RNA，后采用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒對mRNA 進行反轉(zhuǎn)錄，再采用實時熒光定量PCR 技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)各時期中實驗組（涂有LN）和對照組（涂有PBS）增殖期標(biāo)志基因Pax7及成肌分化標(biāo)志基因MyHC的表達情況。qRT-PCR 反應(yīng)體系：上、下游引物各0.5 μL（0.25 μmol/L），Mix 10 μL，cDNA分別為2 μL，RNase free water 補至20 μL。反應(yīng)條件：95℃10 min、95℃10 s、60℃20 s、72℃15 s，重復(fù)35 個循環(huán)。qRT-PCR 反應(yīng)引物序列見表1。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化期蛋白表達水平 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞傳代后接種于已涂層的6 孔板，用預(yù)熱的無酶PBS 清洗細(xì)胞1 次，增殖12 h 和增殖24 h 的孔板每孔加入200 μL 的RIPA 裂解液（加入1% 的蛋白酶抑制劑混合物），分化24 h和分化48 h 的孔板每孔加入300 μL。反復(fù)吹吸至細(xì)胞全部裂解，將裂解后的細(xì)胞液加入1.5 mL 無酶管中。12 000 r/min，4℃，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL無酶管中，-80℃保存。采用BCA 法測定樣品的蛋白濃度。增殖期Western blot 上樣量為10 μg，分化期Western blot 上樣量為15 μg。電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，根據(jù)目的條帶大小和Protein Marker 的位置選擇切膜，將膜放入含有Pax7、MyHC或GAPDH一抗的雜交袋中，封口，4℃過夜，孵育完用TBST 搖床清洗5～6 次，每次5 min。根據(jù)一抗的物種選擇羊抗鼠或者羊抗兔二抗，二抗室溫?fù)u床孵育1 h，孵育完用TBST 搖床清洗5～6 次，每次5 min。發(fā)光液的配置根據(jù)需要量按試劑A 和試劑B 等體積混合，避光保存。

1.10 統(tǒng)計分析 EdU 細(xì)胞增殖檢測實驗中細(xì)胞增殖率結(jié)果采用卡方檢驗進行分析；熒光定量PCR 和Western blot 結(jié)果采用T 檢驗進行分析，其中熒光定量PCR 結(jié)果按2-ΔΔCt計算，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因?qū)z測的目的基因進行歸一化。

2 結(jié)果

2.1 LN 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖能力的影響 由圖1可見，LN 處理組中牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞EdU 陽性細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞增值率與對照組無顯著差異。這表明在培養(yǎng)皿中涂有LN 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖率沒有影響。

如圖2 所示，在增殖12 h 和增殖24 h 時Pax7的mRNA 水平表達與對照組均無顯著性差異。標(biāo)志因子Pax7 的蛋白表達水平（圖3）與qRT-PCR 檢測的mRNA表達水平一致，Pax7在增殖2 個時期與對照組均無顯著性差異。結(jié)果表明LN 涂板后培養(yǎng)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞，對體外培養(yǎng)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。

2.2 LN 對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化的影響 待細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中分化24～48 h，用顯微鏡觀察其成肌分化后肌管形成狀態(tài)。由圖4 可知，與涂有PBS 陰性對照培養(yǎng)的牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞相比，培養(yǎng)皿涂有LN 后牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化形成的肌管數(shù)量較多，直徑明顯大于對照組。

表1 qRT-PCR 引物序列

由圖5 可知，LN 涂板培養(yǎng)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞后MyHC的mRNA 水平在分化24 h 和分化48 h 均呈上調(diào)趨勢，在分化24 h 上調(diào)極顯著，分化48 h 上調(diào)不顯著。由圖6 可見，在2 個分化時間點MyHC的蛋白表達水平也均呈上調(diào)趨勢，分化24 h 時上調(diào)不顯著，但在分化48 h上調(diào)極顯著。結(jié)果表明LN 涂板后培養(yǎng)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞，可使牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外培養(yǎng)分化進程提前，具有促進牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的能力。

3 討 論

Kleinman 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ECM 在調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動中具有很重要的作用，不同的ECM 成分影響培養(yǎng)細(xì)胞不同的行為特性。本實驗主要研究ECM 中基底膜的重要蛋白組成成分LN，它與細(xì)胞的遷移、增殖和分化密切相關(guān)[16]。關(guān)于LN 作用于體外細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究發(fā)現(xiàn)LN 可促進癌細(xì)胞移動和黏附[17]。本研究結(jié)果表明，LN 涂板后對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)的增殖能力沒有影響；LN 處理培養(yǎng)皿后，分化形成的肌管融合程度高于對照組，肌管數(shù)量較多，直徑明顯大于對照組，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化標(biāo)志因子MyHC的mRNA 水平在分化24 h 極顯著上調(diào)，蛋白水平在分化48 h 極顯著上調(diào)，mRNA 和蛋白質(zhì)表達水平變化不同步，推測可能是由于轉(zhuǎn)錄后翻譯的多樣性造成的，也可能與 mRNA 及蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)。特定基因的mRNA 豐度與其翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的表達量不一定呈線性關(guān)系[18]，因為基因表達的調(diào)控層次很多，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控只是一個環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯及翻譯后調(diào)控都對最后蛋白的表達量起作用。mRNA 降解、蛋白降解、修飾折疊等因素都可能導(dǎo)致mRNA 豐度與蛋白表達水平不一致。

Wilschut 等[19]研究表明，在LN 和纖維連接蛋白涂層上，豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞Pax7的mRNA 持續(xù)表達，細(xì)胞團簇形成；在基質(zhì)凝膠和LN 上，豬原代肌衛(wèi)星細(xì)胞Pax7和MyHC的mRNA 表達水平增加，表明對于豬原代肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，LN 涂層優(yōu)于干細(xì)胞研究中常用的涂層，發(fā)現(xiàn)它能維持肌肉干細(xì)胞增殖能力和改善肌肉干細(xì)胞分化進程。本實驗中研究的Pax7結(jié)果與Wilschut 等[19]研究結(jié)果不一致，分析主要原因：首先是種屬差異，其次是LN 的鋪板時長不一樣，最后是qRT-PCR 檢測Pax7的時間點不一致。本實驗是在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至增殖12、24 h 檢測Pax7，而Wilschut等[21]實驗中在更換分化培養(yǎng)基后0、2、5 d 進行檢測。MyHC在分化期的研究結(jié)果與Wilschut 等[19]實驗變化一致，支持了這一觀點。MyHC是骨骼肌分化終末期的標(biāo)志基因[20]。本研究中LN 處理后肌衛(wèi)星MyHC表達顯著上調(diào)，說明LN 涂板處理可提前牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化進程。

4 結(jié) 論

本研究以LN 作為培養(yǎng)皿涂板底物，體外培養(yǎng)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，通過EdU 細(xì)胞增殖檢測、qRT-PCR 和Western blot 實驗技術(shù)檢測牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化標(biāo)志基因的表達變化，發(fā)現(xiàn)LN 涂板處理后可以促進牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程，驗證了LN 涂板作用在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的生物功能，此研究結(jié)果為肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化及利用提供一定參考。