從江香豬OB 基因序列及對(duì)皮下脂肪前體細(xì)胞的調(diào)控研究

朱曉鋒 ，謝玲玲，許厚強(qiáng)，田念念，崔小芝，吳巧群，李 雄，楊 云，倪萌萌*

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州貴陽(yáng) 550018；3.思南縣畜牧發(fā)展中心，貴州銅仁 565100）

肥胖基因（OBsese，OB）于1954 年在小鼠中被首次發(fā)現(xiàn)，屬于常染色體隱性遺傳，直到1994 年，Zhang 等[1]利用定位克隆技術(shù)成功克隆出小鼠的OB基因及人類的同源基因序列，其表達(dá)產(chǎn)物為瘦素蛋白（Leptin），是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的可調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪儲(chǔ)蓄量的內(nèi)分泌因子[2]。第1 個(gè)外顯子氨基酸N-端的2 個(gè)半胱氨酸形成內(nèi)二硫鍵并以單體形式存在于血液中[3]，對(duì)能量代謝、體器官發(fā)育、動(dòng)物繁殖以及造血系統(tǒng)均具有一定的調(diào)節(jié)功能[4]。例如，當(dāng)OB基因或OBR基因突變導(dǎo)致瘦素不能正常表達(dá)時(shí)，可導(dǎo)致動(dòng)物不育，用瘦素刺激生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)可恢復(fù)不育動(dòng)物的生育能力[5-6]，于是Huertas 等[7]通過(guò)抑制OB/OBR軸實(shí)驗(yàn)探究性地開發(fā)了抵抗炎癥缺陷的治療方法。也有研究證實(shí)下丘腦是瘦素長(zhǎng)型受體分布的主要部位，瘦素直接或間接與NPY、POMC（Proopiomelanocortin，促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原）神經(jīng)元結(jié)合，進(jìn)而投射到LHA（Lateral Hypothalamic Area，下丘腦側(cè)翼區(qū)），參與瘦素代謝循環(huán)以調(diào)節(jié)動(dòng)物的攝食和體重穩(wěn)態(tài)[8]，是因?yàn)槎；视王；D(zhuǎn)移酶1基因（Diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1）參與著脂質(zhì)產(chǎn)量合成[9-11]。ACACA作為脂肪合成過(guò)程中的限速酶，則伴隨成熟脂肪細(xì)胞的增殖而優(yōu)先表達(dá)[12-15]，隨著ACACA的表達(dá)，脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）也隨即表達(dá)，主要參與乳腺短鏈、中鏈脂肪酸的合成[15-18]，而且FASN基因上存在的多個(gè)與脂肪呈顯著相關(guān)的SNPs，直接影響著FASN奶牛乳脂的合成和代謝[19-20]。也有研究證實(shí)脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）和過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ，PPARγ）參與AKT 信號(hào)通路，影響奶牛乳脂含量和脂肪酸組成[21-22]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于畜禽OB基因的報(bào)道較少，對(duì)OB基因調(diào)控脂質(zhì)代謝的分子作用機(jī)制尚且模糊。

從江香豬屬于我國(guó)地方小型豬種之一，有著生長(zhǎng)遲緩、個(gè)體矮小等優(yōu)良的地方豬種種質(zhì)特性，在醫(yī)療及模式動(dòng)物的資源挖掘方面有著特殊的價(jià)值[23]。本文以從江香豬脂肪組織mRNA 為模板，結(jié)合RT-PCR、在線軟件及測(cè)序方法完整克隆、分析了OB基因全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)分析OB基因在不同豬種不同組織中的mRNA 表達(dá)情況；構(gòu)建OB基因的表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染從江香豬皮下脂肪前體細(xì)胞，初步探究從江香豬OB基因的分子作用機(jī)制，為構(gòu)建從江香豬肥胖動(dòng)物模型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自貴州大學(xué)香豬育種場(chǎng)，選取飼養(yǎng)環(huán)境相同的純種從江香豬、大白豬和蘇香雜交豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)國(guó)家屠宰標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屠宰。按實(shí)驗(yàn)需要立即采取動(dòng)物心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌9 個(gè)組織器官樣品，經(jīng)滅菌后的DEPC 水處理，用滅菌錫箔紙包好并分別寫上標(biāo)記，放入液氮罐中暫時(shí)保存，后置于-80℃冰箱待用。

主要實(shí)驗(yàn)試劑：2×Taq Master Mix、DM2000 Marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與LipofectamineTM3000 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾（Thermo）科技有限公司；RNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自莫納生物科技有限公司（珠海）；pMD19-T 載體、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀BIO-RAD CFX96TMReal-Time System（美國(guó)）購(gòu)自廣州安邦生物科技有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)GenBank 中公布的豬OB基因的序列（序列號(hào)為：U63540.1），運(yùn)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)從江香豬OB基因的擴(kuò)增引物，由重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。Trizol 法提取從江香豬不同組織器官的總RNA，RTPCR 進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成。逆轉(zhuǎn)錄步驟：向無(wú)核酸酶的PCR 管中加入Oligo(dT) 1 μL、隨機(jī)六聚體引物1 μL、組織模板總RNA 1 μL，用nuclease-free water補(bǔ)足12 μL，然后65℃孵育5 min，再向以上得到的12 μL混液中加入10× dNTP Mix 4 μL、5×Reaction Buffer 2 μL、RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，輕微震蕩離心后放入PCR 儀，反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 60 min，75℃ 5 min，4℃短暫保存，后將組織cDNA 置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

以從江香豬組織cDNA 為模板擴(kuò)增OB基因CDS 區(qū)504 bp，反應(yīng)總體系20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA 模板1 μL，nuclease-free water 補(bǔ)足至20 μL。PCR 程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)充延伸7 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳條帶正確后，純化片段連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化于JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出陽(yáng)性單菌落，經(jīng)重慶擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定，獲得從江香豬OB基因序列。

1.2.2 從江香豬OB基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將1.2.1中測(cè)序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ分別同時(shí)雙酶切pMD19-T-OB質(zhì)粒和pEGFP-C1空載體，酶切體系：10×Fast Digest Green Buffer 3 μL、Fast Digest enzyme 1.5 μL、質(zhì)粒4 μL、nuclease-free water補(bǔ)足30 μL?；厥占兓盖械钠?，16℃連接過(guò)夜，連接液轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞中，卡納抗生素培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切檢測(cè)和測(cè)序鑒定，測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒抽提，用于細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

表1 相關(guān)基因引物序列信息

1.2.3 從江香豬OB基因序列及結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)測(cè)序結(jié)果，結(jié)合在線軟件分析OB基因蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（https://web.expasy.org/protparam/）、二級(jí)結(jié)構(gòu)（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）、跨膜結(jié)構(gòu)域（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、亞細(xì)胞定位（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）及信號(hào)肽位點(diǎn)等，利用RNA Web Services（http://rna.tbi.univie.ac.at/）檢測(cè)其最小自由能。通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)查找野豬（Sus Scrofa）、人（Homo Sapiens）、獼猴（Macaca Mulatta）、黑猩猩（Pan Troglodytes）、綿羊（Ovis Aries）、山羊（Capra Hircus）、家犬（Canis Lupus Familiaris）、貓（Felis Catus）、雞（Gallus Gallus）、大鼠（Rattus Norvegicus）、小家鼠（Mus Musculus）和斑馬魚（Danio Rerio）OB基因的開放閱讀框，利用Bio Edit 軟件分析從江香豬OB基因與該13 個(gè)物種核酸序列一致性，通過(guò)MAGA6.0 軟件構(gòu)建OB基因CDS 區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同豬種OB基因各組織表達(dá)及差異分析 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（BIO-RAD CFX96TMReal-Time System）檢測(cè)OB基因在大白豬、從江香豬、蘇香雜交豬3 個(gè)豬種心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌9 個(gè)組織器官中的表達(dá)量，反應(yīng)總體積為10 μL：5 μL NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus、上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、1 μL 組織cDNA 模板、ddH2O 補(bǔ)足10 μL。qPCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min、95℃變性5 s、60℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)，熔解溫度為65～95℃，溫度每升高0.5℃記錄一次熒光信號(hào)。結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算各組織器官的表達(dá)量，運(yùn)用PASW Statistics18.0 進(jìn)行表達(dá)差異及顯著性分析，并用Excel 作圖。

1.2.5 從江香豬皮下脂肪前體細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及表達(dá)檢測(cè) 本研究通過(guò)組織消化法培養(yǎng)從江香豬皮下脂肪前體細(xì)胞，經(jīng)鑒定成功后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。六孔板培養(yǎng)從江香豬皮下脂肪前體細(xì)胞至細(xì)胞數(shù)量達(dá)80%左右，利用LipofectaminTM3000 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒將1.2.2 中的pEGFP-C1-OB表達(dá)載體和pEGFP-C1 空載體分別轉(zhuǎn)染至皮下脂肪前體細(xì)胞，24 h 觀察熒光發(fā)光效果，并作記錄。轉(zhuǎn)染48 h 后，Trizol 法提取從江香豬前體脂肪細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成，在線（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的熒光定量PCR 引物（表2），qPCR 程序和體系與1.2.4 中一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 從江香豬OB基因克隆及序列分析 通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得OB基因CDS 區(qū)全長(zhǎng)序列，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，與預(yù)期條帶大小吻合，且清晰、明亮（圖1-a）。產(chǎn)物送往昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序，純化后獲得從江香豬OB基因504 bp 全長(zhǎng)序列。經(jīng)序列比對(duì)分析，從江香豬OB基因CDS 區(qū)全長(zhǎng)504 bp，序列分析顯示，該基因起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，包含2 個(gè)外顯子，共編碼167 個(gè)氨基酸，其中與GenBank 登錄的野豬（Sus Scrofa）序列相比較，有兩處突變，分別為241 bp 處（T →C）和462 處（G →T），兩處堿基突變均未導(dǎo)致氨基酸變異，為同義突變，說(shuō)明該基因在兩豬種中存在高度保守性，但在不同亞種間存在堿基差異。突變前后RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，野豬的最小自由能為-191.20 kcal/mol（-799.98 KJ/mol），從江香豬的最小自由能為-163.90 kcal/mol（-685.76 KJ/mol），野豬序列較從江香豬序列穩(wěn)定。

表2 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因引物序列信息

2.2 從江香豬OB 蛋白（Leptin）結(jié)構(gòu)與功能分析 理化性質(zhì)分析顯示，從江香豬Leptin 蛋白分子式為C1488H2474N504O613S166，由5 245 個(gè)原子組成，分子量是42.554 98 ku，理論等電點(diǎn)為5.13，該蛋白為酸性蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)19.44，半衰期4.4 h，不穩(wěn)定系數(shù)高達(dá)58.61，說(shuō)明該蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白。序列分析得知，該蛋白質(zhì)含丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Cly）和蘇氨酸（Thr），其中胱氨酸含量最高（32.9%），丙氨酸最低（19.4%）。從江香豬Leptin 蛋白疏水性得分在第96 位氨基酸最高（2.189），在第33 位氨基酸最低（-0.244），總的疏水性平均系數(shù)（Grand Average of Hydropathicity，GRAVY）為0.919，可以推測(cè)該蛋白屬于疏水蛋白（圖2-A）。從江香豬Leptin 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中以α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)形式，比例占61.68%，其次無(wú)規(guī)卷曲，占28.74%，延伸鏈占7.19%，而β-轉(zhuǎn)角占比最少，為2.40%，結(jié)構(gòu)中不含β-折疊，依據(jù)Rost 等[24]所述的判斷方法，從江香豬Leptin 蛋白屬于全α-類蛋白質(zhì)，通過(guò)在線軟件phyre2對(duì)蛋白進(jìn)行同源統(tǒng)計(jì)計(jì)算并構(gòu)建隱馬爾可夫三維模型（圖2-B）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，第1 位至22 位為蛋白信號(hào)肽區(qū)域，概率為86.61%；存在一個(gè)螺旋跨膜結(jié)構(gòu)，概率為84.63%；第99 位至第111 位為一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域（氨基酸序列：NDLENLRDLLHLL），亞細(xì)胞定位為細(xì)胞核中。

2.3OB基因表達(dá)載體的鑒定 將重組質(zhì)粒純化后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ進(jìn)行單、雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小，經(jīng)鑒定，可用于下一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.4OB基因在各豬種不同組織中的表達(dá)差異分析 以野豬（Sus scrofa）的GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，將各豬種心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌9 個(gè)組織器官樣品進(jìn)行均一化處理后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

qRT-PCR 結(jié)果表明，OB基因?qū)儆趶V譜表達(dá)基因，在大白豬、從江香豬和蘇香雜交豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、大腸、小腸、脂肪、背最長(zhǎng)肌9 個(gè)組織器官中均有不同程度的表達(dá)，在各豬種脂肪組織中表達(dá)均極顯著高于其他組織。從江香豬OB基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織，且在心臟、肺臟、腎臟僅存在微量表達(dá)；在脾臟、小腸、背最長(zhǎng)肌中雖有中度表達(dá)，但表達(dá)量依然很低，與大白豬的各組織器官表達(dá)量差異不明顯（圖3-A）。蘇香雜交豬的不同組織中OB基因的表達(dá)量在與大白豬和從江香豬比較中有很大的不同，除了在心臟、腎臟和背最長(zhǎng)肌中低表達(dá)外，在其他幾個(gè)組織中均呈現(xiàn)中高度表達(dá)（圖3-B）。OB基因在不同豬種中的表達(dá)有很大差異的結(jié)果與戴茹娟等[25]報(bào)道的一致。OB基因的高表達(dá)也直接反映了畜禽肉質(zhì)產(chǎn)品的口感和風(fēng)味[26]。

2.5 從江香豬OB基因在物種間的遺傳進(jìn)化分析 如圖4 所示，從江香豬與野豬的同源性最高，為99.6%，其次是反芻動(dòng)物中的綿羊、山羊和牛，分別為93.3%、92.9%和92.3%，家與雞的同源性最低，約為42.1%，結(jié)果與李琴等[27]報(bào)道的相吻合。分析可知，OB基因在物種間的遺傳上具有一定的保守，同屬物種間的遺傳距離較近，且在進(jìn)化樹上聚為同一分支；不同屬的物種間遺傳距離相對(duì)要遠(yuǎn)，并分別聚于不同分支，說(shuō)明OB基因的遺傳存在種間差異，不同種屬間差異較大。

2.6OB基因上調(diào)對(duì)從江香豬脂質(zhì)代謝的影響 分別將3組實(shí)驗(yàn)組（pEGFP-C1-OB載體）和空白對(duì)照組（Blank）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的從江香豬原代皮下脂肪前體細(xì)胞中，各組OB基因的表達(dá)結(jié)果如圖5 所示，各實(shí)驗(yàn)組中OB基因的表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組；表達(dá)載體上調(diào)OB基因表達(dá)，脂質(zhì)代謝相關(guān)基因ACACA、NPY、GPAM的mRNA 水平均顯著上調(diào)，而DGAT1、LPL、PPARγ、FASN的mRNA 水平均極顯著下調(diào)。

3 討 論

部分研究表明OB基因在不同物種、不同組織中的表達(dá)有著極顯著的差異，且只有在成熟的脂肪組織中才有表達(dá)，而在人和小鼠的其他組織中均檢測(cè)不到OB基因的轉(zhuǎn)錄物[28]，反芻動(dòng)物和家禽中沒(méi)有檢測(cè)到OB基因的表達(dá)。也有研究表明，OB基因的表達(dá)產(chǎn)物還存在性別差異，女性血清中的瘦素水平高出男性2～3 倍，且有伴隨著明顯的周期波動(dòng)趨勢(shì)[4]，還有學(xué)者認(rèn)為一定有某種信號(hào)反饋機(jī)制來(lái)維持動(dòng)物體重在一定的范圍內(nèi)。可見(jiàn)，伴隨著人們生活水平的提高，肥胖研究已經(jīng)成為倍受關(guān)注的話題，但對(duì)肥胖基因調(diào)控地方畜種生命活動(dòng)分子機(jī)制的研究較少，給本實(shí)驗(yàn)研究從江香豬肥胖癥動(dòng)物模型帶來(lái)一定的阻力。

本研究利用生物信息學(xué)有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)、在線序列結(jié)構(gòu)分析軟件、qRT-PCR 方法，對(duì)從江香豬OB基因進(jìn)行序列及組織表達(dá)分析，結(jié)果顯示，突變后RNA 自由能降低了27.3 kcal/mol（114.27 Kj/mol），這一突變可能與其RNA 在從江香豬脂肪組織中的高表達(dá)有關(guān)[2]?；蚓幋a區(qū)核酸序列與其他12 個(gè)物種間比較結(jié)果表明，與野豬的同源性最近，不同種屬間的遺傳距離較遠(yuǎn)，并且對(duì)應(yīng)的各重要性氨基酸具有高度的保守性[29]。OB基因在純種從江香豬脂肪中的表達(dá)量極顯著高于其他組織，且脂肪組織表達(dá)量極顯著高于大白豬，說(shuō)明純種從江香豬屬于脂肪型豬種。然而，在蘇香雜交豬各組織中出現(xiàn)了多個(gè)組織高表達(dá)現(xiàn)象，說(shuō)明蘇香雜交豬仍保持著脂肪型豬種的表達(dá)特征，但造成這種現(xiàn)象的機(jī)制目前尚不清楚[30]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，從江香豬皮下脂肪前體細(xì)胞中OB基因的過(guò)表達(dá)能導(dǎo)致NPY、ACACA、GPAM基因的mRNA 表達(dá)水平極顯著上調(diào)。有研究顯示，乙酰輔酶A 羧化酶A 作為脂肪酸合成的關(guān)鍵限速酶，可與乙酰輔酶A 作用生成丙二酸單酰輔酶A，進(jìn)而在脂肪酸合成酶的作用下生成軟脂酸，軟脂酸經(jīng)高爾基體加工合成為多種脂肪酸。Mercer 等[31]利用基因敲除技術(shù)培育出OB/OB缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)NPY基因在其下丘腦中出現(xiàn)超表達(dá)現(xiàn)象，利用瘦素處理后，小鼠下丘腦的NPY的mRNA 合成明顯降低，與本研究結(jié)果相符。Li等[32]成功鑒定了線粒體GPAM為miR-223 的靶點(diǎn)，并驗(yàn)證了miR-223 通過(guò)靶向GPAM抑制肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化。由此可見(jiàn)，NPY、ACACA和GPAM均是影響脂質(zhì)合成代謝的關(guān)鍵性基因。Lan 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ的mRNA 和蛋白質(zhì)的水平受到一種新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lnc-HC）的負(fù)調(diào)控，通過(guò)減少lnc-HC 表達(dá)顯著減少miR-130b-3p 的表達(dá)量，誘發(fā)PPARγ表達(dá)，從而增加了高脂血癥大鼠肝臟中的甘油三酯濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，OB基因的過(guò)表達(dá)能使DGAT1、LPL、PPARγ、FASN基因的表達(dá)量極顯著下降，證實(shí)了OB基因的表達(dá)能夠影響DGAT1、LPL、PPARγ、FASN基因的表達(dá)，但是它們之間相互調(diào)控的具體機(jī)制尚不清楚。本研究提示NPY、ACACA、GPAM與OB基因之間可能以正調(diào)控方式參與脂肪的合成代謝，而DGAT1、LPL、PPARγ、FASN可能作為OB基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

本研究發(fā)現(xiàn)了OB基因在純種從江香豬和蘇香雜交豬種上的表達(dá)差異，在雜交豬的肝臟、脾臟、肺臟、大腸、小腸和脂肪中均出現(xiàn)了中高度表達(dá)，與葉鼎承等[26-28]報(bào)道的結(jié)果有差異，這種差異可能是由于雜交豬和純種地方豬之間的不同導(dǎo)致的，具體原因還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。此結(jié)果可為從江香豬新品系選育和提高豬肉品質(zhì)提供新的思路，也可為預(yù)防和治療脂肪相關(guān)疾病動(dòng)物模型提供參考資料。OB基因的上調(diào)可導(dǎo)致脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因不同程度的高表達(dá)或抑制，揭示OB基因的表達(dá)作用由多基因、多種調(diào)節(jié)方式、多個(gè)作用因子構(gòu)成，為進(jìn)一步研究OB基因在肥胖癥中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)理論。

4 結(jié) 論

本研究克隆了從江香豬OB基因包含兩個(gè)外顯子的全長(zhǎng)編碼區(qū)序列，在線分析其理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)功能發(fā)現(xiàn)，OB基因表達(dá)蛋白為不穩(wěn)定酸性蛋白，分子量為42.554 98 ku，在遺傳上存在高度保守性，與野豬的遺傳距離最近。運(yùn)用qRT-PCR 檢測(cè)到OB基因在從江香豬脂肪組織中的mRNA 表達(dá)水平極顯著高于其他組織，且不同豬種中的表達(dá)量有很大差異。構(gòu)建pEGFP-C1-OB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染從江香豬皮下脂肪前體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NPY、ACACA、GPAM基因的表達(dá)水平上調(diào)，而DGAT1、LPL、PPARγ、FASN基因的表達(dá)受到抑制，揭示了OB基因在動(dòng)物脂肪合成和代謝過(guò)程中發(fā)揮著的重要作用，結(jié)果可為進(jìn)一步研究OB基因調(diào)控脂質(zhì)細(xì)胞代謝的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。