草原紅牛Bcl2L13 的CDS 克隆及其在不同組織的表達(dá)規(guī)律研究

劉理想 ，高 一，秦立紅,3,4，呂 陽(yáng)，薛佳佳，吳 健,3,4，胡忠昌，張國(guó)梁,3,4*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林公主嶺 136100；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130000；3.吉林坤成牧業(yè)科技發(fā)展有限公司，吉林公主嶺 136100；4.吉林省肉牛繁育及養(yǎng)殖技術(shù)科技創(chuàng)新中心 吉林公主嶺 136100）

草原紅牛是我國(guó)成功培育的第一個(gè)肉乳兼用型優(yōu)良品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼的特點(diǎn)；屠宰率和凈肉率分別達(dá)到56.5%和43.9%[1]；肉質(zhì)鮮嫩，肌間脂肪沉積良好，大理石花紋等級(jí)平均為5 級(jí)，在國(guó)內(nèi)屬于優(yōu)秀牛肉[2]。肌間脂肪沉積是體脂分配、血液脂質(zhì)代謝、脂肪酸組成、脂肪代謝關(guān)鍵基因及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等綜合作用的結(jié)果[3]。因此探究脂肪代謝調(diào)控關(guān)鍵因子具有重要意義。

Bcl-2L13（Bcl-2-like Protein 13）基因是B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族成員之一，定位于線粒體，是一種線粒體外膜蛋白[4]，于2001 年被Kataoka 等[5]研究發(fā)現(xiàn)在人的心臟、胰腺和胎盤組織中的mRNA 表達(dá)水平較高。Ju 等[6]研究報(bào)道，Bcl-2L13基因敲除導(dǎo)致米色脂肪細(xì)胞分化后脂質(zhì)積聚減少，Bcl-2L13的轉(zhuǎn)錄被PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮上調(diào)，Bcl-2L13在體內(nèi)由b3-腎上腺素激動(dòng)劑CL-316、CL-243 刺激的白色脂肪組織褐變過程中以及在體外米色脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)增加，表明Bcl-2L13可能是PPARγ介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞重塑的關(guān)鍵效應(yīng)因子。

氧化磷酸化是脂肪細(xì)胞分化過程中ATP 產(chǎn)生的主要機(jī)制，而成骨細(xì)胞使用糖酵解來滿足ATP 需求[7]。Guntur 等[8]研究報(bào)道，小鼠前脂肪細(xì)胞系3T3-L1 分化過程中主要通過氧化磷酸化來滿足ATP 需求。Fujiwara 等[9]研究報(bào)道，在小鼠前脂肪細(xì)胞系3T3-L1 和小鼠耳間充質(zhì)干細(xì)胞（EMSCs）誘導(dǎo)分化中，Bcl-2L13基因敲除使油紅O 染色減少，主成脂肪轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的mRNA 表達(dá)量也減少，氧化磷酸化顯著減少，糖酵解產(chǎn)生的ATP 顯著增加，Bcl-2L13通過增加氧化磷酸化，抑制細(xì)胞凋亡，并通過有絲分裂調(diào)控線粒體進(jìn)一步促進(jìn)脂肪生成。因此，通過對(duì)Bcl-2L13基因與脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系進(jìn)行探究，不僅能夠?qū)χ|(zhì)代謝紊亂產(chǎn)生的各種疾病更加了解，而且為改善牛肉品質(zhì)提供一定的理論參考依據(jù)，從而進(jìn)一步提高養(yǎng)殖行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

最新研究表明，Bcl-2L13基因與脂肪生成有關(guān)，本試驗(yàn)研究隨機(jī)挑選12 頭18 月齡的草原紅牛，通過對(duì)其血液DNA 提取和組織RNA 提取，以TA 克隆的方法完整地克隆了草原紅牛Bcl-2L13基因的編碼區(qū)，采用生物信息分析軟件對(duì)克隆序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)了該基因在草原紅牛心臟、肺臟、脾臟等組織的表達(dá)差異，為進(jìn)一步提高草原紅牛牛肉品質(zhì)提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)牛由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，隨機(jī)挑選12 頭18 月齡的草原紅牛公牛，送至屠宰場(chǎng)屠宰，期間收集心、肝、脾、肺、腎臟等組織，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑、儀器 膠回收純化試劑盒（Omega）、Trizol（Invitrogen）、小提質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen）、pMD18-T 載體（TaKaRa）、5×PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa）、2×ES Taq Master Mix（CWBIO）、Light Cycler 480 SYBR GreenIMaste（Roche）、Quawell-Q5000超微量分光光度計(jì)（北京鼎盛）。

1.2 RNA 提取 Trizol 法提取心、肺、脾、肝、腎臟等各組織總RNA；用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA 的濃度和OD260/280。

1.3 cDNA的制備 反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL，其中5×PrimeScript RT Master Mix 添加量為2 μL；RNA 添加量為500 ng；然后用RNase-Free H2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15 min；85℃ 5 s。反應(yīng)完畢，收集產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)牛Bcl-2L13基因（GenBank 登錄號(hào)：NM_001078082.2）完整編碼區(qū)的擴(kuò)增引物；在Bcl-2L13核苷酸序列的編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量所需引物，實(shí)時(shí)熒光定量的管家基因?yàn)棣?actin（GenBank 登錄號(hào)：NM_173979），具體信息見表1。所設(shè)計(jì)的所有引物交由蘇州金唯智合成。

表1 引物信息

1.6 PCR 擴(kuò)增和TA 克隆 PCR 體系為50 μL，其中ddH2O水添加量為 20 μL，2×ES Taq MasterMix添加量為25 μL，F(xiàn)/R 引物添加量各為1.25 μL，cDNA 添加量為2.5 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；95℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 52 s；34 個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，置于4℃保存?zhèn)溆?。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，凝膠濃度為1%。鑒定完畢后產(chǎn)物利用DNA 純化回收試劑盒回收。TA 克隆：體系為10 μL；其中膠回收產(chǎn)物添加量為4 μL；solutionI添加量為5 μL ；pMD18-T 載體添加量為 1 μL。將以上試劑混勻4℃過夜，次日將連接產(chǎn)物與大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞按照1:10 的比例混勻，置于冰上30 min，然后放入42℃水浴鍋90 s，再放置冰上3 min，然后加入無抗生素LB培養(yǎng)液800 μL，室溫下置于搖床（200 g）復(fù)蘇1 h，復(fù)蘇結(jié)束后取200 μL 菌液涂板，平板為含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB 固體平板，涂好后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。次日挑取8 份單菌落，然后加入到含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中混勻，室溫下置于搖床（200 g）過夜。次日用質(zhì)粒小提試劑盒提質(zhì)粒，提取成功后以其為模板進(jìn)行菌落PCR。將鑒定正確的菌液交由蘇州金維智測(cè)序。

1.7 生物信息學(xué)分析 利用DNAStar 軟件將測(cè)序結(jié)果與野豬（登錄號(hào)：XM_003126595.6）、白鯨（XM_022577 139.1）、白豚（XM_007469525.1）、虎鯨（XM_004286 267.2）、寬吻海豚（XM_019926055.1）、普通牛（NM_001078082.2）、瘤牛（XM_019959968.1）、駱駝（XM_010964106.1）、牦牛（XM_014478065.1 ）、綿羊（XM_012175613.3）、人（NM_015367.4）、山羊（XM_0180 48707.1）、亞洲水牛（XM_025282917.1）、羊駝（XM_015244912.1）這些物種的Bcl-2L13基因mRNA 序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并用Megalign 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用DNAstar 將測(cè)序結(jié)果翻譯為氨基酸序列；利用ExPASY 對(duì)Bcl-2L13 蛋白理化特性和蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用ProtScale 對(duì)Bcl-2L13 蛋白親疏水性進(jìn)行分析；利用NetPlos2.0Server 軟件對(duì)Bcl-2L13 蛋白進(jìn)行磷酸化分析；利用DNAStar 軟件預(yù)測(cè)Bcl-2L13 的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 構(gòu)建Bcl-2L13 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以制備的各組織的cDNA 為模板，管家基因?yàn)棣?actin，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，其中LightCycler 480 SYBR GreenI Maste添加量為10 μL ；ddH2O添加量為8 μL；F/R（10 μmol/L）添加量各位0.5 μL；cDNA 添加量為1 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，設(shè)置43個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s，65℃ 1 min，升溫速率5℃/s，從65℃遞增到97℃，反應(yīng)至40℃結(jié)束。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 采用2-△△Ct方法，收集實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用GraphPad Prism 軟件，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1Bcl-2L13基因的PCR 結(jié)果 以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠濃度為1%。凝膠成像分析儀顯示一條大小約2020 bp 的條帶（圖1），與理論擴(kuò)增目的條帶長(zhǎng)度一致。

2.2Bcl-2L13基因同源性分析以及系統(tǒng)進(jìn)化分析 草原紅牛Bcl-2L13基因與普通牛、牦牛的同源性最高（100% 和99.3%），和瘤牛、亞洲水牛的同源性分別為91.8%、90.5%，與野豬、白鯨、白豚、虎鯨、寬吻海豚、駱駝、綿羊、人、山羊和羊駝的同源性較低，分別為61.7%、69.8%、74.0%、69.1%、64.8%、63.4%、88.2%、56.9%、88.0%、62.0%，具體結(jié)果見圖2。由圖3 可知，與草原紅牛進(jìn)化關(guān)系密切的是普通牛和牦牛，而親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的是虎鯨。

2.3 Bcl-2L13 蛋白理化性質(zhì) ExPASy 軟件的具體分析結(jié)果見表2，Bcl-2L13基因編碼279 個(gè)氨基酸，有39個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu），16 個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）。Bcl-2L13 蛋白質(zhì)分子式：C1348H2108N348O439S5，蛋白分子量是30.374 ku，pI為4.51。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為77.71，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.4 Bcl-2L13 蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位 Target P 軟件的具體分析結(jié)果見表3，Bcl-2L13 蛋白在線粒體中存在很少，較少地分布于分泌途徑。PSORT II 軟件的具體分析結(jié)果表明，Bcl-2L13 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)（65.2%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（4.3%）、過氧化物酶體（8.7%）、細(xì)胞骨架（4.3%）、線粒體（4.3%）及細(xì)胞核（13.0%）內(nèi)有少量分布。

2.5 Bcl-2L13 蛋白親水性、疏水性和磷酸化分析 Protscale軟件的具體分析結(jié)果見圖4，由圖可知Bcl-2L13 蛋白總平均親水性為-0.250，這一結(jié)果表明Bcl-2L13 蛋白屬于水溶性蛋白。Net Phos3.1 軟件的具體分析結(jié)果見圖5，Bcl-2L13 蛋白共有33 個(gè)磷酸化位點(diǎn)（分值大于0.5），絲氨酸（Serine）20 處，蘇氨酸（Threonine）9處，酪氨酸（Tyrosine）4 處。

2.6 Bcl-2L13 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Bcl-2L13蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用DNAStar 軟件，具體結(jié)果見圖6，Bcl-2L13 蛋白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要形式包括22.4%的α-螺旋、12.1%的β-轉(zhuǎn)角、31.0%的β折疊、34.5%的無規(guī)則卷曲。Bcl-2L13 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建采用SWISS-MODEL（圖7），與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式相吻合。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果分析 對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如圖8 所示，以肺臟組織為對(duì)照，Bcl-2L13在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，在肺組織中表達(dá)量最少，，草原紅牛Bcl-2L13基因在不同組織中的表達(dá)存在顯著差異（除了脾臟和十二指腸），在心臟、背最長(zhǎng)肌中極顯著表達(dá)。

表2 草原紅牛Bcl-2L13 蛋白的氨基酸組成

表3 Target P 分析結(jié)果

3 討 論

Bcl-2L13基因是Kataoka 等[5]研究鑒定的一個(gè)新的廣泛表達(dá)的Bcl-2 同源物，Bcl-2L13基因的BH 基序過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力影響小，而C-末端膜錨（MA）結(jié)構(gòu)域的過表達(dá)導(dǎo)致多數(shù)細(xì)胞凋亡，BHNo 結(jié)構(gòu)域過表達(dá)的細(xì)胞凋亡率略低于C-末端膜錨（MA），表明Bcl-2L13基因具有促細(xì)胞凋亡功能。Kim 等[10]研究報(bào)道，Bcl-2L13基因的MA 結(jié)構(gòu)域缺失突變導(dǎo)致Bcl-2L13促細(xì)胞凋亡功能的消失?？芍狹A 以及BHNo 結(jié)構(gòu)域是Bcl-2L13基因促細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵部位，而BH 基序結(jié)構(gòu)域可能參與其他生物學(xué)功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ju 等[6]研究報(bào)道，Bcl-2L13基因敲除導(dǎo)致米色脂肪細(xì)胞分化后脂質(zhì)積聚減少，Bcl-2L13的轉(zhuǎn)錄被PPARγ 激動(dòng)劑羅格列酮上調(diào)，Bcl-2L13在體內(nèi)由b3-腎上腺素激動(dòng)劑CL-316243 刺激的白色脂肪組織褐變過程中以及在體外米色脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)增加，這些結(jié)果表明Bcl-2L13基因參與脂質(zhì)代謝。本研究成功克隆出草原紅牛Bcl-2L13基因，并利用一系列軟件分析了Bcl-2L13 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)了二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

本研究采用TA 克隆法，克隆了草原紅牛Bcl-2L13基因的完整編碼序列，長(zhǎng)度為839 bp，編碼279 個(gè)氨基酸，該蛋白分子質(zhì)量為30.374 ku，理論等電點(diǎn)為4.51，總平均親水性為-0.250，屬于親水性蛋白。Murakawa等[11]研究表明，小鼠Bcl-2L13基因編碼含有434 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與草原紅牛Bcl-2L13 分子量的差異初步分析與Bcl-2L13基因的低序列保守性有關(guān)。草原紅牛Bcl-2L13的克隆序列與普通牛和牦牛的同源性高（100%和99.3%），符合生物進(jìn)化特征，與野豬、白鯨、白豚、虎鯨、寬吻海豚、駱駝、綿羊、人、山羊和羊駝的同源性分別為61.7%、69.8%、74.0%、69.1%、64.8%、63.4%、88.2%、56.9%、88.0%、62.0%。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位表明，Bcl-2L13 蛋白多位于細(xì)胞質(zhì)中，分泌途徑存在很少，這一結(jié)果與Yi 等[12]研究Bcl-2L13的剪接變體定位于細(xì)胞質(zhì)與線粒體無關(guān)相一致。Nakazawa 等[4]研究表明，C-末端膜錨定區(qū)缺失的Bcl-2L13定位于細(xì)胞質(zhì)，表明C-末端膜錨定區(qū)對(duì)Bcl-2L13定位于線粒體起關(guān)鍵作用。磷酸化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，Bcl-2L13 蛋白存在33 個(gè)磷酸化位點(diǎn)、絲氨酸（Serine）20 處、蘇氨酸（Threonine）9 處、酪氨酸（Tyrosine）4 處，說明該基因與許多酶作用和介導(dǎo)蛋白活性。這一結(jié)果與Kim 等[10]研究得出的Bcl-2L13 通過與腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相符合。通過對(duì)草原紅牛Bcl-2L13 蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要形式為無規(guī)則卷曲，部分為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β折疊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，這一結(jié)果也從側(cè)面驗(yàn)證Bcl-2L13剪接變體的存在[12]。研究表明，Bcl-2L13基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，具有與其他酶作用和介導(dǎo)蛋白活性的作用，繼而影響脂肪代謝，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，Bcl-2L13在不同組織中的表達(dá)量存在明顯差異，以肺臟組織為對(duì)照，Bcl-2L13在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，在肺組織中表達(dá)量最少。檢測(cè)到Bcl-2L13在心臟中相對(duì)表達(dá)量也較高，這一結(jié)果與Aufiero 等[13]關(guān)于Bcl-2L13在心臟中的研究相一致。本研究探究了Bcl-2L13基因在草原紅牛上的基本情況，為進(jìn)一步研究Bcl-2L13基因?qū)倚笾x的影響提供資料。

4 結(jié) 論

本研究采用TA 克隆方法，克隆了草原紅牛Bcl-2L13基因的完整編碼序列，長(zhǎng)度為839 bp，編碼279個(gè)氨基酸，該蛋白分子質(zhì)量為30.374 ku，屬于水溶性蛋白，Bcl-2L13 蛋白共有磷酸化位點(diǎn)33 個(gè)（分值大于0.5）。Bcl-2L13 蛋白蛋白多位于細(xì)胞質(zhì)中，分泌途徑存在很少，其二級(jí)結(jié)構(gòu)形式主要為無規(guī)則卷曲，部分為α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β折疊，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其不穩(wěn)定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，Bcl-2L13在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量最高，在肺組織中表達(dá)量最少，不同組織中Bcl-2L13的表達(dá)存在顯著差異。