高效液相色譜法測定食品中羅丹明B含量的不確定度評(píng)估

□ 朱曉雯 付金鳳 常州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心

引言

羅丹明B（Rhodamine B）是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料，其在溶液中會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，常用于實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。羅丹明B曾經(jīng)被用作食品添加劑，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其存在致癌性后，已被禁止用于食品染色。但是，時(shí)至今日，仍有一些不法商販在各種調(diào)味料的生產(chǎn)中使用羅丹明B以達(dá)到以次充好的目的。

本研究采用高效液相色譜法[1]對(duì)食品中羅丹明B的含量進(jìn)行測定，并依據(jù)《測量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1-2012）[2]和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[3]（CNAS－GL06）對(duì)食品中羅丹明B檢測的不確定度進(jìn)行測量和分析，以期為食品中羅丹明B的檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純），德國默克公司；羅丹明B對(duì)照品（批號(hào)510081-201401），中國食品藥品檢定研究院；供試樣品為花椒油（批號(hào)：2016.04.08），廠家A。

1.2 儀器與設(shè)備

島津高效液相色譜儀LC-20A，日本島津公司；METTLER XP105電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液︰乙腈（45︰55）；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長550nm、發(fā)射波長580nm；流速：1mL/min；柱溫：5℃；進(jìn)樣量：10μL；等度洗脫。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取羅丹明B對(duì)照品10mg置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用移液管精密吸取0.5mL儲(chǔ)備液至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，作為標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。用含0.1%甲酸的乙腈水溶液將中間標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備方法

稱取試樣1g（精確到0.01g）置于50mL離心管中，加入10.0mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液混勻后于漩渦混勻器上渦旋15min，再于8000r/min離心10min，取3mL提取液層過0.45μm有機(jī)相濾膜待凈化。將上述提取液1mL移至固相萃取小柱中，加樣前先分別用3mL甲醇與水活化，上樣后依次用3mL0.1%甲酸水溶液、3mL水、3mL甲醇淋洗固相萃取柱。然后，用6mL氨水甲醇溶液洗脫目標(biāo)物，收集流出液，在45℃水浴中氮?dú)獯蹈?，?.5mL0.1%甲酸的乙腈水溶液溶解殘?jiān)ㄟ^0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶，作為供試品溶液。

1.3.4 測定方法

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液10μL進(jìn)樣，依據(jù)上述色譜條件，以保留時(shí)間定性，用外標(biāo)法計(jì)算試樣中羅丹明B的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測量數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中羅丹明B的含量按照公式計(jì)算：

式中：X為羅丹明B的含量，mg/kg；c為試樣中羅丹明B峰面積對(duì)應(yīng)的濃度，ng/mL；V為試樣定容體積，mL；m為稱樣量，g；f為稀釋因子。

2.2 各分量不確定度的來源

①標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度：a.標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度u（Wr）,b.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程引入的不確定度u（Vr）；②供試品溶液引入的不確定度：a.樣品稱量引入的不確定度u（Wx）,b.樣品稀釋過程引入的不確定度u（Vx）；③高效液相色譜儀引入的不確定度u（y）；④樣品加標(biāo)回收率重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度u（FRec）。

2.3 不確定度分量的評(píng)定

2.3.1 樣品制備過程引入的不確定度

2.3.1.1 樣品稱量過程

根據(jù)天平檢定證書，50g內(nèi)所使用天平的最大允差為±0.0005g，置信區(qū)間為95%。稱量2次，按正態(tài)分布，取，則。樣品稱量5次，分別為1.0213、1.0225、1.0156、1.0278、1.0106g，對(duì)應(yīng)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：6.92×10-4、6.91×10-4、6.96×10-4、6.88×10-4、7.00×10-4。

則樣品稱量引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.1.2 樣品制備稀釋過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

玻璃儀器在20℃校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室溫度在(20±5)℃范圍內(nèi)波動(dòng)，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按均勻分布計(jì)算，，溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的水體積不確定度為。

由于樣品制備過程中使用了1、10mL移液管（均為A級(jí)），因此按照《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）[4]的要求，均有相應(yīng)的允許偏差。按照矩形分布考慮，，由此估算本實(shí)驗(yàn)中涉及到的玻璃器皿的相對(duì)不確定度分量分別為4.09×10-3、1.30×10-3。

樣品制備過程中稀釋因子引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 對(duì)照品溶液制備過程引入的不確定度

2.3.2.1 對(duì)照品稱量過程

根據(jù)天平檢定證書，十萬分之一天平的最大稱量誤差為±0.1mg。稱量2次，按正態(tài)分布，取，則，稱取10mg羅丹明B由天平引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.3.2.2 對(duì)照品制備過程中稀釋因子

對(duì)照品溶液制備過程中使用了10、25、50、100mL容量瓶及1mL移液管，均為A級(jí)。對(duì)照品制備稀釋過程中引入與涉及到的玻璃器皿的相對(duì)不確定度分量分別為 1.30×10-3、6.06×10-4、8.37×10-4、5.80×10-3、4.09×10-3，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 高效液相色譜儀引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本研究采用島津高效液相色譜儀LC-20A進(jìn)行測定，校準(zhǔn)證書上儀器的定量重復(fù)性誤差為1.1%（n=5），則液相色譜儀的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

2.3.4 樣品溶液制備過程中由重復(fù)性引起的不確定度及由樣品取樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品重復(fù)測定6次，回收率實(shí)驗(yàn)中的回收率分別為89.05%、87.27%、89.56%、86.41%、90.17%、88.26%，平均回收率為88.4%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為正態(tài)分布，置信水平95%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。式中：s為標(biāo)準(zhǔn)偏差；FRec為平均回收率；n為回收率實(shí)驗(yàn)6次。

2.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

通過實(shí)驗(yàn)測得平均加樣含量為0.0052mg/kg，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0052×0.0174=9.05×10-5mg/kg。

2.5 擴(kuò)展不確定度

在95%置信區(qū)間下，取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定 度 為 9.05×10-5×2=1.81×10-4mg/kg， 以 樣 品 平 均含量測得0.0052mg/kg，故本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定度為0.0052±1.81×10-4mg/kg（k=2）。

3 結(jié)論

本研究對(duì)食品中添加羅丹明B含量檢測的不確定度來源進(jìn)行了較為全面的分析，從研究結(jié)果可知，其主要來源為對(duì)照品稱量、稀釋過程及供試品稀釋過程引入的不確定度。因此，在實(shí)際檢測工作中，天平的定期檢定與維護(hù)保養(yǎng)、玻璃量器的校準(zhǔn)，以及實(shí)驗(yàn)室溫濕度[5]的控制對(duì)進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性具有重要意義。