Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝

黃周鋒 胡筱希 黃建猷 譚曉 陸國壽 梁新巧

中圖分類號 R283.3 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1085-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.12

摘 要 目的：優(yōu)化小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝。方法：以檸檬酚含量為評價指標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、硫酸銨加入量、超聲時間、超聲溫度為考察因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化小槐花中檸檬酚的提取工藝并進行驗證。結(jié)果：小槐花中檸檬酚的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)95.35%，固液比1 ∶ 50.35（g/mL），硫酸銨加入量4.49 g，超聲時間48.7 min，超聲溫度57.6 ℃。3次驗證試驗中，檸檬酚的含量分別為0.637 8、0.638 4、0.625 4 mg/g，與預(yù)測值（0.630 5 mg/g）相近。結(jié)論：優(yōu)化的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝穩(wěn)定、可行，可用于小槐花中檸檬酚的提取。

關(guān)鍵詞 小槐花;檸檬酚;雙水相提取;超聲提取;Box-Behnken設(shè)計;響應(yīng)面法;工藝優(yōu)化

Optimization of Ultrasonic-assisted Ethanol-（NH4）2SO4 Aqueous Two-phase Extraction of Citrusinol from Desmodium caudatum by Box-Behnken Design-response Surface Methodology

HUANG Zhoufeng1，2，HU Xiaoxi1，HUANG Jianyou1，TAN Xiao1，LU Guoshou1，LIANG Xinqiao3（1. Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences， Nanning 530022， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards， Nanning 530022， China; 3. College of Pharmacy， Guangxi University of TCM， Nanning 530022， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To optimize ultrasonic-assisted ethanol-（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction technology of citru- sinol from Desmodium caudatum. METHODS： Using the content of citrusinol as indexes， with ethanol volume fraction， solid-liquid ratio， （NH4）2SO4 addition amount， ultrasonic time and ultrasonic temperature as factors， based on the single factor tests， Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the extraction technology of citrusinol. RESULTS： The optimized extraction technology of citrusinol included that ethanol volume fraction was 95.35%， the solid-liquid ratio was 1 ∶ 50.35 （g/mL）， （NH4）2SO4 addition amount was 4.49 g， ultrasonic time was 48.7 min， ultrasonic temperature was 57.6 ℃. In 3 times of validation tests， the extraction rates of citrusinol were 0.637 8， 0.638 4， 0.625 4 mg/g， respectively， which was close to predicted value （0.630 5 mg/g）. CONCLUSIONS： The optimized ultrasonic-assisted ethanol-（NH4）2SO4 aqueous two-phase extraction technology is stable and feasible， and can be used for the extraction of citrusinol from D. caudatum.

KEYWORDS? ?Desmodium caudatum; Citrusinol; Aqueous two-phase extraction; Ultrasonic extraction; Box-Behnken design; Response surface methodology; Technology optimization

小槐花[Desmodium caudatum（Thunb.）DC.]為豆科山螞蝗屬植物，以全株入藥，為廣西壯、瑤民族常用藥材，被收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[1]、《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]、《中國瑤藥學(xué)》[3]。小槐花壯藥名為棵文沾，瑤藥名為握麻紅，主要分布于廣西、安徽、浙江、江西等省。本課題組前期對壯瑤藥小槐花進行了深入的研究，并從中提取分離出了一種A環(huán)并吡喃環(huán)黃酮結(jié)構(gòu)的化合物檸檬酚（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）;隨后的活性研究發(fā)現(xiàn)，該化合物可通過破壞人肝癌HepG2細(xì)胞的F-actin骨架，阻止紡錘體形成，從而抑制癌細(xì)胞的增殖，并呈劑量依賴性，提示檸檬酚具有潛在的抗腫瘤作用[4-9]。

目前，黃酮類化合物多以有機溶劑回流或超聲提取，溶劑用量大且后續(xù)處理復(fù)雜[10-11]。雙水相提取具有分相快、條件溫和、操作安全方便、污染小等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分分離和生物化學(xué)等領(lǐng)域[12-15]。中藥中的活性成分大多為微量成分，且初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物共存，因此為提高活性成分的提取效果，本研究以乙醇-硫酸銨為雙水相[16]（與常見的碳酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化銨等鹽相比，硫酸銨在乙醇中的溶解度更低，更利于黃酮類成分的分離），利用超聲與雙水相體系相結(jié)合的方法提取小槐花中的檸檬酚;以檸檬酚含量為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，旨在為小槐花藥材中活性成分的有效提取及其進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）;HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）;JJ224BC型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）;KS- 3200DE型超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）;LDZ4-0.8A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）。

1.2 藥品與試劑

小槐花藥材采自廣西鹿寨縣，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院盧文杰主任中藥師鑒定為小槐花[D. caudatum（Thunb.）DC.]的全草，標(biāo)本存放于廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院中藥研究所標(biāo)本室;檸檬酚對照品（本實驗室自制，HPLC法檢測純度：≥98%）;甲醇為色譜純，磷酸、乙醇、硫酸銨等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 小槐花粗提物的制備

稱取小槐花藥材600 g，加20倍量（mL/g）50%乙醇，于90 ℃回流提取2次，每次1 h;合并2次提取液，減壓濃縮至200 mL后，加乙醇500 mL醇沉;濾過，濾液蒸干，即得粗提物35.41 g。

2.2 檸檬酚的含量測定

采用HPLC法檢測。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBrige-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（80 ∶ 20，V/V）;測定波長：282 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備 ①對照品貯備液：精密稱取檸檬酚對照品1.0 mg，加無水乙醇定容至5 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）使溶解，制得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的對照品貯備液，備用。②供試品溶液：精密稱取“2.1”項下所得粗提物0.2 g，加無水乙醇定容至50 mL，超聲使溶解，制得供試品溶液。③空白溶液：取適量無水乙醇溶液經(jīng)超聲處理后，作為空白溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取對照品溶液（50 μg/mL，用無水乙醇將“2.2.2①”項下對照品貯備液稀釋所得）、供試品溶液、空白溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（見圖2）。結(jié)果，供試品溶液與對照品溶液在相應(yīng)位置有相同的色譜峰，且空白溶液對待測物的測定無干擾;理論板數(shù)按檸檬酚計不低于2 000，分離度>1.5，表明本方法專屬性強。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2①”項下對照品貯備液適量，用無水乙醇稀釋，得質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質(zhì)量濃度（c，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程為A=48 790c+64 160（R2=0.999 3），檸檬酚檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為6.25～200 μg/mL。

2.2.5 定量限與檢測限考察 取“2.2.4”項下線性范圍下限質(zhì)量濃度（6.25 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用無水乙醇倍比稀釋，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，檸檬酚的定量限、檢測限分別為293、88 ng/mL。

2.2.6 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗 ①取“2.2.4”項下50 μg/mL檸檬酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果，檸檬酚峰面積的RSD為1.35%（n=6），表明儀器精密度良好。②取同一批粗提物樣品共6份，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，按外標(biāo)法計算檸檬酚的含量（mg/g）。結(jié)果，樣品中檸檬酚的平均含量為0.587 2 mg/g，RSD為1.01%（n=6），表明本方法的重復(fù)性較好。③取同一份供試品溶液，在室溫下分別放置0、2、4、6、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，得檸檬酚峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知檸檬酚含量的小槐花粗提物約1.0 g，共6份，分別加入一定量的對照品貯備液，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算檸檬酚的加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.3 單因素試驗

精密稱取小槐花粗提物適量，以檸檬酚含量為評價指標(biāo)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)（80%～100%）、固液比[1 ∶ 40～ 1 ∶ 60（g/mL，下同）]、硫酸銨加入量（1.5～5.5 g）、超聲時間（20～60 min）、超聲溫度（30～70 ℃）等因素[13]進行單因素試驗。

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在固液比為1 ∶ 40、硫酸銨加入量為1.5 g、超聲溫度為30 ℃、超聲時間為20 min的條件下，分別用80%、85%、90%、95%、100%乙醇進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標(biāo)法計算樣品中檸檬酚的含量。結(jié)果，乙醇的體積分?jǐn)?shù)可影響雙水相的分水能力，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%～90%時，檸檬酚含量有隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而降低的趨勢;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>90%時，檸檬酚含量有隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而升高的趨勢;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時，檸檬酚的含量最高，且趨于穩(wěn)定，詳見圖3A。

2.3.2 固液比 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、硫酸銨加入量為1.5 g、超聲溫度為30 ℃、超聲時間為20 min的條件下，分別以固液比1 ∶ 40、1 ∶ 45、1 ∶ 50、1 ∶ 55、1 ∶ 60進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標(biāo)法計算樣品中檸檬酚的含量。結(jié)果，當(dāng)固液比為1 ∶ 40～1 ∶ 50時，檸檬酚含量有上升的趨勢，提示增加溶劑量可有助于提高檸檬酚的溶出程度;當(dāng)固液比超過1 ∶ 50后，檸檬酚含量先下降再升高，含量的下降可能與大量雜質(zhì)溶出有關(guān)，詳見圖3B。

2.3.3 硫酸銨加入量 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、固液比為1 ∶ 40、超聲溫度為30 ℃、超聲時間為20 min的條件下，分別加入硫酸銨1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 g進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標(biāo)法計算樣品中檸檬酚的含量。結(jié)果，當(dāng)硫酸銨加入量為1.5～2.5 g時，檸檬酚含量隨著硫酸銨加入量的增加而降低;當(dāng)硫酸銨加入量為2.5～4.5 g時，檸檬酚含量也隨之增加;當(dāng)硫酸銨加入量>4.5 g時，檸檬酚含量增加不明顯，且若再繼續(xù)加入硫酸銨，則雙水相體系飽和，使得其分相能力減弱，詳見圖3C。

2.3.4 超聲時間 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、固液比為1 ∶ 40、超聲溫度為30 ℃、硫酸銨加入量為1.5 g的條件下，分別超聲提取20、30、40、50、60 min。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標(biāo)法計算樣品中檸檬酚的含量。結(jié)果，當(dāng)超聲時間為20～50 min時，檸檬酚含量呈波浪形上升;而當(dāng)超聲時間>50 min時，檸檬酚含量有所下降;當(dāng)超聲時間為50 min時，檸檬酚含量最高，詳見圖3D。

2.3.5 超聲溫度 精密稱取小槐花粗提物0.2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、固液比為1 ∶ 40、超聲時間為20 min、硫酸銨加入量為1.5 g的條件下，分別在30、40、50、60、70 ℃下進行提取。取提取液適量，按“2.2.2②”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，并按外標(biāo)法計算樣品中檸檬酚的含量。結(jié)果，當(dāng)超聲溫度為30～50 ℃時，檸檬酚含量的變化并不明顯;當(dāng)超聲溫度為50～60 ℃，檸檬酚含量明顯上升，且于60 ℃時達(dá)到最大值;當(dāng)超聲溫度>60 ℃時，檸檬酚的含量又有所下降，詳見圖3E。

2.4 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 試驗設(shè)計 根據(jù)“2.3”項下單因素試驗結(jié)果和響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、固液比（B）、硫酸銨加入量（C）、超聲時間（D）、超聲溫度（E）等5個因素為響應(yīng)因素，以檸檬酚含量為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計5因素3水平響應(yīng)面試驗，因素與水平見表2，試驗方案及結(jié)果見表3。

2.4.2 模型建立與方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行擬合，并建立二次多元回歸方程：Y=0.630+3.211×10-3A+0.015B-0.010C-0.013D-0.019E-0.045AB+0.015AC+0.048AD+0.018AE-4.720×10-3BC-5.124×10-3BD-0.063BE+2.843×10-3CD+7.192×10-3CE+0.051DE-0.076A2-0.096B2-0.073C2-0.052D2-0.086E2。對其進行方差分析，結(jié)果見表4。

由表4中模型的P值（<0.000 1）可知，該模型的擬合程度良好;檸檬酚含量與各試驗因素之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.953 5），校正系數(shù)（R2Adj）為0.916 3，提示91.63%的檸檬酚含量變化可用該模型解釋，因此可用該模型分析和預(yù)測檸檬酚含量。由F值可知，5個因素對檸檬酚含量的影響大小為：E（超聲溫度）>B（固液比）>D（超聲時間）>C（硫酸銨加入量）>A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）;由各一次項對應(yīng)的P值可知，除A外，其余因素均對檸檬酚含量具有顯著影響（P<0.05）;由各二次項對應(yīng)的P值可知，5個因素均對檸檬酚含量具有顯著影響（P<0.000 1）;在交互相中，A與B、A與D、B與E、D與E之間具有顯著的交互作用（P<0.01）。

為進一步評價A與B、A與D、B與E、D與E之間交互作用對檸檬酚含量的影響并確定各因素的最佳水平范圍，本研究采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖4。由圖4可見，上述交互因素的響應(yīng)面形狀均較陡，等高線均呈明顯的橢圓形，說明各交互作用均較為明顯。求解二次多元回歸方程，得檸檬酚最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)95.35%，固液比1 ∶ 50.35（g/mL），硫酸銨加入量4.49 g，超聲時間48.7 min，超聲溫度57.6 ℃;預(yù)測檸檬酸含量為0.630 5 mg/g。

2.5 驗證試驗

精密稱取小槐花粗提物0.2 g，按“2.4”項下最優(yōu)工藝平行操作3次，所得檸檬酚的含量分別為0.637 8、0.638 4、0.625 4 mg/g，平均含量為0.633 9 mg/g（RSD=1.15%，n=3），與預(yù)測值0.630 5 mg/g相近（實測值與預(yù)測值的RSD為1.16%，n=3）。

3 討論

黃酮類化合物在植物體內(nèi)主要以糖苷形式存在，游離的較少，現(xiàn)多采用回流或者超聲法進行提取[10-11，17]。雙水相提取由于具有操作簡便、分相快等優(yōu)點，故在中藥成分提取分離中的應(yīng)用日益廣泛[12]。雙水相體系含水量較高，與植物體內(nèi)的生理環(huán)境相似;反應(yīng)條件溫和，不容易造成活性成分發(fā)生改變;再輔以超聲、微波等手段，可進一步改善提取的效果[18]。乙醇-硫酸銨系統(tǒng)是常見的雙水相體系之一，其分離原理為：無機鹽在溶液中可電離出正、負(fù)離子，兩種離子在兩相間的分配系數(shù)不同，故而形成電位差，當(dāng)被提取物進入雙水相體系后，由于其中所含化合物表面性質(zhì)、電荷作用和分子間作用力的差異，導(dǎo)致其在提取過程中的化學(xué)平衡發(fā)生了變化，最終使得目標(biāo)成分轉(zhuǎn)移至乙醇相，從而增加了目標(biāo)成分的溶出速度和效率[19-20]。有研究指出，影響雙水相成相的因素很多，如溫度、pH值、雙水相物質(zhì)組成及含量等;同時，目標(biāo)成分的結(jié)構(gòu)差異也是能否形成雙水相及各成分在兩相中分布的關(guān)鍵因素[21]。因此，對雙水相提取條件進行優(yōu)化可準(zhǔn)確預(yù)測體系中的分配規(guī)律，從而有效指導(dǎo)該技術(shù)的應(yīng)用?；诖耍狙芯恳詸幟史雍繛橹笜?biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法對超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取小槐花中檸檬酚的工藝進行了優(yōu)化。

在前期預(yù)試驗中，本課題組對檸檬酚的定量分析條件進行了篩選，包括流動相（乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸水溶液）、流速（1.0、0.8、0.6 mL/min）、柱溫（20、25、30 ℃）等。綜合考慮色譜響應(yīng)以及色譜峰峰形、分離度等因素，最終確定了“2.2.1”項的色譜條件。

本研究進一步參考已有文獻[13]，對超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝的乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、硫酸銨加入量、超聲溫度、超聲時間等5個因素進行單因素試驗;在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化。結(jié)果，由回歸模型預(yù)測超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取檸檬酚的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)95.35%，固液比1 ∶ 50.35（g/mL），硫酸銨加入量4.49 g，超聲時間48.7 min，超聲溫度57.6 ℃;檸檬酚預(yù)測含量為0.630 5 mg/g。經(jīng)過3次驗證試驗，得檸檬酚的平均含量為0.633 9 mg/g，與預(yù)測值相近。檸檬酚為一種A環(huán)并吡喃環(huán)黃酮類化合物，回流或超聲提取所得產(chǎn)物的含量較低[17]，而本研究優(yōu)化的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝可大大提高小槐花提取物中該化合物的含量。

綜上所述，本研究優(yōu)化所得的小槐花中檸檬酚的超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取工藝穩(wěn)定、可行。中藥成分復(fù)雜，傳統(tǒng)分離手段步驟繁多且耗時長，雙水相作為一種綠色環(huán)保的新型分離技術(shù)，可簡化樣品前處理過程，易于放大生產(chǎn)且可連續(xù)化操作，有助于單體化合物的分離[12-15]。但該法在應(yīng)用時也存在一些不足，如分離選擇性偏低、易乳化、相分離時間較長等，后續(xù)可結(jié)合聯(lián)用高速逆流色譜、電泳等技術(shù)[22]來進一步提高提取效率。

參考文獻

[ 1 ] 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第1冊[S]. 1990年版.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1990：24.

[ 2 ] 廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：第1卷[S].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2008：49.

[ 3 ] 覃迅云，羅金裕，高志剛.中國瑤藥學(xué)[M].北京：民族出版社，2002：934.

[ 4 ] 盧文杰，陸國壽，譚曉，等.壯瑤藥小槐花化學(xué)成分研究[J].中藥材，2013，36（12）：1953-1956.

[ 5 ] 劉瑛，陸國壽，盧文杰，等.檸檬酚對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響[J].天然產(chǎn)物開發(fā)與研究，2017，29（1）：135-140.

[ 6 ] 陸國壽，葉勇，盧文杰，等.壯、瑤藥小槐花中異檸檬酚的分離鑒定及含量測定研究[J].天然產(chǎn)物開發(fā)與研究，2014，26（9）：1450-1453.

[ 7 ] 陸國壽，譚曉，陳家源，等.小槐花中的脂溶性成分分析[J].廣西科學(xué)，2012，19（4）：355-357.

[ 8 ] 李燕婧，鐘正賢，盧文杰.小槐花水提物藥理作用研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，19（4）：76-78.

[ 9 ] 李燕婧，鐘正賢，盧文杰.小槐花醇提物藥理作用研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2013，34（5）：64-65.

[10] 李曉斌，陳振斌，楊旸，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化槐葉中黃酮類化合物的提取工藝[J].中國藥房，2015，26（7）：960- 964.

[11] 羅旭東，李成義，李俊岳，等.當(dāng)歸葉總黃酮提取工藝優(yōu)化[J].遼寧中醫(yī)雜志，2018，45（7）：1456-1459.

[12] 劉磊磊，李秀娜，趙帥.雙水相萃取在中藥活性成分提取分離中的應(yīng)用進展[J].中草藥，2015，46（5）：766-773.

[13] 何自強，張惠玲，蘇天明.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助乙醇-K2HPO4雙水相提取紅景天苷[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2018，30（7）：1257-1265.

[14] 宋力飛，劉常青，李曼莎，等.星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪雙水相萃取工藝[J].中成藥，2017，39（1）：71-75.

[15] 張琳，周欣，趙鳳平，等.乙醇-硫酸銨雙水相提取陳皮黃酮工藝的優(yōu)化[J].中成藥，2018，40（7）：1510-1514.

[16] 趙立輝，武文潔，楊昱涵.雙水相系統(tǒng)純化山楂葉黃酮類物質(zhì)的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2009，21（5）：849-853.

[17] 邢東旭，廖森泰，李慶榮，等.僵蠶總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化[J].中成藥，2017，39（8）：1727-1730.

[18] 朱紅菊，丁玉，賈亞偉，等. 桔皮中橙皮苷的新型雙水相萃取[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2013，32（9）：995-1001.

[19] 肖星輝，張向前，李桂芳，等.雙水相萃取荒漠肉蓯蓉總黃酮及其抗氧化活性[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（16）：5-9.

[20] 陳麗娟，柳福智，岳強兵.正交試驗法優(yōu)化微波協(xié)同雙水相提取甘草中總黃酮的工藝[J].中國藥房，2016，27（4）：525-528.

[21] 劉紹鵬，宗志敏，魏晴，等.雙水相體系中成相及有機物分配機理的初步研究[J].化工時刊，2010，24（12）：21-24.

[22] 李挺，曹學(xué)麗，董銀卯.雙水相體系逆流色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2006，26（2）：83-88.

（收稿日期：2019-08-07 修回日期：2020-02-07）

（編輯：張元媛）