加味舒心湯對急性心梗大鼠再灌注損傷的干預(yù)

林冬銘　陳超　陸明　楊明　石晨卉　黃抒偉

[摘要] 目的 探討加味舒心湯對急性心梗大鼠再灌注損傷的保護作用。 方法 45只SD大鼠，建立氣虛血瘀模型，隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組（Control組）及加味舒心湯干預(yù)組（Treated組）。Sham組只開胸穿線不結(jié)扎，Control組與Treated組建立心梗再灌注模型。再灌注1周后觀察各組的超聲心動圖，比較心肌無復(fù)流面積、心肌梗死面積及HE染色。 結(jié)果 超聲心動圖結(jié)果顯示Control組的左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）和左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）較Sham組擴大（P<0.05），左室短軸縮短率（FS）較假手術(shù)組降低（P<0.05）;Treated組與Control相比，LVESD及LVEDD有改善（P<0.05），且LVEF和FS得到提高（P<0.05）;心肌無復(fù)流面積和心肌梗死面積比較，Treated組的梗死面積和無復(fù)流面積較Control組縮小（P<0.05）。 結(jié)論 加味舒心湯可改善急性心梗大鼠的再灌注損傷。

[關(guān)鍵詞] 加味舒心湯;急性心肌梗死;再灌注損傷;大鼠

[中圖分類號] R542.22? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）14-0034-04

[Abstract] Objective To explore the protective effect of Jiawei Shuxin Decoction on reperfusion injury in rats with acute myocardial infarction. Methods The qi deficiency and blood stasis model was established for 45 SD rats and they were randomly divided into sham operation group（sham group）， model group（control group） and Jiawei Shuxin Decoction intervention group（treatment group）. The Sham group was only given open chest surgery and needle threading without ligation. The control group and the treatment group were given the established myocardial infarction reperfusion model. The echocardiogram in each group was observed after one week of reperfusion， and the myocardial no-reflow area，myocardial infarction area，and HE staining were compared. Results The echocardiographic results showed that the left ventricular end systolic diameter（LVESD） and left ventricular end diastolic diameter（LVEDD） in the control group were larger than those in the sham group（P<0.05）. Left ventricular short-axis shortening rate was lower than that in the sham group（P<0.05）. Compared with the control group，the LVESD and LVEDD in the treatment group were improved（P<0.05）， and LVEF， FS was improved（P<0.05）. Myocardial no-reflow area and myocardial infarction area were compared，and the infarct area and no-reflow area in the treatment group were smaller than those in the control group（P<0.05）. Conclusion Jiawei Shuxin decoction can improve reperfusion injury in rats with acute myocardial infarction.

[Key words] Jiawei Shuxin decoction;Acute myocardial infarction;Reperfusion injury;Rats

近年來，雖然急性心肌梗死的死亡率較前下降明顯[1-4]，但其總體預(yù)后仍有待進一步提高。急性心肌梗死主要是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動脈血供的中斷或急劇下降，使心肌嚴重而持久的急性缺血，最終出現(xiàn)心肌細胞壞死。其病理進程相對明確，但如何進一步優(yōu)化其治療，仍是研究的重要課題。在優(yōu)化急性心梗西醫(yī)治療方案的同時，中醫(yī)中藥亦發(fā)揮著重要作用。諸多研究證實，中醫(yī)藥可以改善急性心肌梗死的再灌注損傷。

加味舒心湯是全國名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師程志清教授針對氣虛血瘀型冠心病擬定的經(jīng)驗方，其以益氣活血、化瘀通絡(luò)為治則，在臨床上取得了良好的療效[5-8]。但對于該經(jīng)驗方的病理生理作用及機制尚未進行深入研究。本研究擬在臨床研究的基礎(chǔ)上開展實驗研究，探討加味舒心湯對急性心梗的再灌注影響，為該方的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠45只，雄性，體重（250±10）g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，許可證號：SYXK（浙）2018-0012;實驗動物生產(chǎn)單位為上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號為：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 實驗藥品

加味舒心湯：該方以黃芪為君藥，由生黃芪15 g，太子參15 g，麥冬12 g，五味子5 g，丹參15 g，絳香9 g，赤芍12 g，柴胡10 g，枳殼12 g，紅景天12 g，瓜蔞皮12 g，薤白9 g，郁金12 g組成。研究采用原方等量顆粒劑（根據(jù)顆粒藥材說明書，折合成顆粒劑為：黃芪顆粒2.25 g，太子參顆粒 2.25 g，麥冬顆粒3.60 g，五味子顆粒0.83 g，丹參顆粒3.00 g，降香顆粒0.75 g，赤芍顆粒1.80 g，柴胡顆粒1.67 g，枳殼顆粒2.00 g，紅景天顆粒1.20 g，瓜蔞皮顆粒3.60 g，薤白顆粒2.25 g，郁金顆粒1.20 g），中藥顆粒購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院。

1.3 建模及分組

1.3.1 氣虛血瘀型大鼠模型建立? （1）饑餓：測得SD大鼠常規(guī)飲食量為25 g/（只·d），按60%的常規(guī)飲食量飼養(yǎng)，即15 g/（只·d），分為早晨8點8 g/（只·d），晚8點7 g/（只·d）;（2）疲勞：每天在深45 cm水桶中游泳，水溫（37.5±0.5）℃，出現(xiàn)下沉?xí)r撈出;（3）高脂飲食：每天按10 mL/kg脂肪乳灌胃。以上操作程序持續(xù)10 d。

1.3.2 動物與分組? 45只氣虛血瘀型SD大鼠，隨機分為3組，每組15只。（1）假手術(shù)組（Sham組），只開胸穿線不結(jié)扎，每天予等量生理鹽水灌胃;（2）模型組（Control組），每天予等量生理鹽水灌胃;（3）加味舒心湯干預(yù)組（Treated組），將顆粒劑溶于500 mL生理鹽水，以10 mL/（kg·d）給藥，每天灌胃。各組在心肌梗死再灌注模型構(gòu)建成功后當(dāng)天開始灌胃給藥，灌胃給藥治療共計4周。

1.3.3 心梗再灌注模型的建立? 除假手術(shù)組只開胸穿線不結(jié)扎外，其余各組均參照文獻[9]建立心梗再灌注模型。方法如下：麻醉后固定大鼠，氣管插管連呼吸機;碘伏消毒胸前區(qū)，從左側(cè)3～4肋間打開胸腔，放入擴胸器充分暴露心臟;鑷子撥開心包，充分暴露肺動脈圓錐及左心耳下緣，結(jié)扎部位為肺動脈圓錐與左心耳下緣連線中點靠下處，使用6-0號線結(jié)扎該處心?。⊿ham組大鼠只穿線不結(jié)扎）;觀察心臟變化，左室前壁及心尖部由紅色變?yōu)樯n白色說明結(jié)扎成功，否則重新結(jié)扎。結(jié)扎1 h后，解開結(jié)扎線進行再灌注，關(guān)胸縫合皮膚，再次用碘伏消毒，待大鼠脫機后拔出氣管插管，并放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.4 觀察指標

1.4.1 各組間用心臟超聲評價心功能? 再灌注1周行超聲心功能檢查[包括左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（FS）、左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）和左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）]。

1.4.2 心肌無復(fù)流面積和心肌梗死面積比較? 1周后處死大鼠，處死前予伊文氏藍、硫黃素染色，取下心臟，切片行石蠟包埋。以AutoCAD2019圖形設(shè)計軟件計算大鼠心肌各斷面缺血區(qū)域面積（Risk area，RA）、梗死區(qū)域面積（Myocardial infarction area，MIA）及無復(fù)流區(qū)域的面積（No-reflow Area，NRA）。大鼠心肌缺血區(qū)面積以各斷面RA之和/左心室各斷面面積（Left ventricle area，LVA）之和表示，即RA/LVA;梗死面積則為各斷面MIA 之和/LVA之和，即為MIA/LVA;而無復(fù)流的面積則為NRA之和/LVA之和，即NRA/LVA[10-11]。

1.4.3 各組間Hematoxylin-Eosin（HE）染色病理組織學(xué)比較? 1周后處死大鼠，取下心臟，切片行石蠟包埋。經(jīng)過切片與貼片、脫蠟、水化、染色、脫水透明、封固處理，比較各組間HE染色結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計量資料均以（x±s）表示，方差齊性者，三組間比較用方差分析，多個均數(shù)間兩兩比較用LSD-t檢驗;兩組間比較用獨立樣本t檢驗，若方差不齊性者，兩組間比較用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 再灌注1周各組大鼠超聲心動圖結(jié)果比較

再灌注1周后心超比較，模型組（Control組）、假手術(shù)組（Sham組）及加味舒心湯干預(yù)組（Treated組）三組間有差異。模型組（Control組）的左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）和左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）較假手術(shù)組（Sham組）擴大，左室短軸縮短率（FS）較假手術(shù)組（Sham組）降低;加味舒心湯干預(yù)組（Treated組）與模型組（Control組）相比，LVESD及LVEDD有改善，且LVEF和FS得到提高，見表1。超聲心動圖見封三圖2。

2.2 各組再灌注心肌心肌梗死、無復(fù)流面積比較

模型組（Control組）與加味舒心湯干預(yù)組（Treated組）相比缺血面積比相似（P>0.05），表明各組間基線一致，其梗死面積及無復(fù)流面積具有可比性。與模型組（Control組）相比，加味舒心湯干預(yù)組（Treated組）的梗死面積和無復(fù)流面積縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠心肌組織HE染色病理變化

假手術(shù)組（Sham組）HE染色可見大鼠心肌組織排列規(guī)則整齊，胞質(zhì)染色均勻成粉紅色，細胞核形態(tài)規(guī)則，橢圓居中，淋巴細胞較少。模型組（Control組）梗死區(qū)心肌細胞排列紊亂、增粗，間隙較正常增大，細胞核形態(tài)不規(guī)則改變，并出現(xiàn)炎癥細胞浸潤和間質(zhì)纖維化。加味舒心湯干預(yù)組（Treated組）心肌組織較模型組（Control組）明顯改善，見封三圖3。

3 討論

在心血管領(lǐng)域，冠脈介入及溶栓技術(shù)的發(fā)展使冠脈大血管問題迎刃而解，然而缺血再灌注損傷仍是一個棘手的難題[12]。急性心肌梗死最重要的治療手段是盡早恢復(fù)冠脈血供，但缺血的心肌組織再次恢復(fù)灌注時會發(fā)生不可逆的損傷，被稱為缺血再灌注損傷。研究證實其機制主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)、鈣超載、炎癥因子及線粒體膜通透性等相關(guān)[13-14]。

祖國醫(yī)學(xué)在減少缺血再灌注損傷方面進行了不少探索，諸多研究證實，中醫(yī)藥不僅能改善心肌缺血癥狀，還存在對缺血再灌注的保護機制。在中藥單體方面，Liu H等[15]發(fā)現(xiàn)姜黃素可改善心肌缺血再灌注損傷，且機制與氧化應(yīng)激相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，梔子提取物梔子苷能減少LDH、CK的漏出，提升SOD的活力，降低MDA的含量，減輕心肌細胞損傷[16]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，苦豆子的有效成分苦豆堿能降低心肌細胞中的炎癥因子，如TNF-ɑ、IL-6和IL-1β濃度，并通過增加p-PI3K和p-AKT蛋白水平發(fā)揮細胞保護作用[17]。于佳慧等[18]認為中藥丹參提取物丹參酮ⅡA可改善心肌細胞活性，降低P62、Beclin-1及LC3Ⅱ等自噬相關(guān)蛋白表達，促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，改善細胞凋亡;Refli Hasan等[19]研究認為月桂葉提取物可改善大鼠心肌梗死，且機制與C反應(yīng)蛋白與髓過氧化物酶相關(guān)。在中藥組方方面，益氣解毒方可減輕細胞鈣超載，并通過調(diào)控外源性凋亡途徑改善心肌細胞凋亡[20]。芪參顆粒[21]能降低細胞內(nèi)炎癥因子相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮減輕心肌細胞的損傷作用。痰瘀同治方[22]可減少自噬小體，降低Beclin-1的表達，表明中藥復(fù)方痰瘀同治方預(yù)處理可以保護心肌細胞的缺血再灌注損傷;芪參膠囊可通過MEK/ERK途徑改善心肌梗死大鼠心功能并促進新生血管生成[23]。

加味舒心湯是全國名老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師程志清教授的經(jīng)驗方，程老認為冠心病的發(fā)病基礎(chǔ)為心氣虛，“氣虛而血滯”及“氣弱而血不行”，正如王清任所言“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，血液在血管中運行勢必遲緩乃至瘀阻”。程老對氣虛血瘀型冠心病治以益氣活血、化瘀通絡(luò)之法，在陸青芷教授舒心寶基礎(chǔ)上擬定加味舒心湯，在臨床上應(yīng)用取得良效。該方以黃芪生脈飲為基礎(chǔ)方：方中黃芪甘溫，補氣固表，太子參甘微寒，補心陰振元氣，益氣復(fù)脈安神。麥冬甘寒，具有滋陰益精、養(yǎng)陰益氣之功效。五味子酸溫，斂肺止汗，生津止渴，兼斂耗散之氣，收先天天癸之原。太子參、麥冬、五味子三藥相合，補、清、斂相得。方中加用丹參、降香、赤芍、柴胡、枳殼以行氣活血化瘀;紅景天健脾益氣，活血化瘀;瓜蔞皮、薤白舒胸宣痹;郁金理氣活血;全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血舒痹之功效。

本研究以經(jīng)驗方加味舒心湯為研究對象，開展實驗研究，研究發(fā)現(xiàn)心梗缺血再灌注大鼠予加味舒心湯治療1周后左室內(nèi)徑和射血分數(shù)等均有所改善，提示加味舒心湯可改善心室重構(gòu)、降低心梗后心衰的發(fā)生率;同時實驗結(jié)果顯示其能減輕急性心肌梗死后的心肌損傷，縮小NR面積，為中醫(yī)藥治療缺血再灌注損傷提供新的途徑;心肌細胞HE染色亦證實，加味舒心湯可以改善炎癥細胞浸潤及心肌纖維化。

但本研究仍存在一定的局限性，因研究樣本量較少，故需要更多的樣本來明確加味舒心湯的療效，且研究周期短，需進一步延長再灌注后觀測時間來評估加味舒心湯的中遠期療效，再者本研究未涉及機制研究，僅局限于動物實驗。

下階段擬進一步擴大樣本量，擬再次證實加味舒心湯對于急性心梗大鼠缺血再灌注的保護作用。同時，目前對于加味舒心湯的作用機制尚不明確，將以Neuregulin-1自分泌為靶點進一步探討其作用機制。

[參考文獻]

[1] Li J，Li X，Wang Q，et al. ST-segment elevation myocardial infarction in China from 2001 to 2011（the China PEACE-Retrospective Acute Myocardial.Infarction Study）：A retrospective analysis of hospital data[J]. Lancet，2015， 385（9966）：441-451.

[2] Mozaffarian D，Benjamin EJ，Go AS，et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update：A report from the American Heart Association[J]. Circulation，2015，131（4）：e29-e322.

[3] Mozaffarian D，Benjamin EJ，Go AS，et al. Executive summary：Heart disease and stroke statistics-2015 update：A report from the American Heart Association[J]. Circulation，2015，131（4）：434-441.

[4] 陳偉偉，高潤霖，劉力生，等.《中國心血管病報（2014））》概要[J]. 中國循環(huán)雜志，2015，（7）：617-622.

[5] 程志清. 冠心病證治體會[J]. 山東中醫(yī)雜志，2000，19（10）：585-586.

[6] 程志清，俞麗霞. 舒心寶治療心氣虛證臨床與實驗研究[J]. 中國醫(yī)藥學(xué)報，1992，7（2）：20-22.

[7] 劉強. 程志清教授診治冠心病心絞痛臨證經(jīng)驗述要[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，12（1）：1407-1409，1413.

[8] 石占利. 程志清“疏肝氣通胸陽”辨治冠心病經(jīng)驗探析[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，41（1）：38-41.

[9] McComfick ME，Collins C，Makarewich CA，et al. Platelet endothelial cell adhesion molecule.1 mediates endothelial-cardiomyocyte commanication and regulates cardiac function[J].J Am Hearl Assoc，2015，4（1）：e001210.

[10] 林冬銘，黃抒偉，陸明，等. 丹參酮ⅡA對兔急性心梗再灌注后無復(fù)流的干預(yù)[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（7）：1649-1651.

[11] 王琳莉，黃抒偉，竇麗萍，等. 丹參酮IIA磺酸鈉對兔急性心梗再灌注后無復(fù)流的保護作用[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34（3）：678-682.

[12] Cugg TT，Morel O，Cayla G，et al. Cyclosporine before PCI in patients with acute myocardial infarction[J]. N Engl J Med，2015，373（11）：1021-1031.

[13] Kalogeris T，Baines CP，Krenz M，et al. Ischemia/reperfusion[J]. Compr Physiol，2016，7：113-170.

[14] Kohlhauer M，Pell VR，Burger N，et al. Protection against cardiac ischemia-reperfusion injury by hypothermia and by inhibition of succinale accumulation and oxidation is additive[J]. Basic Res Cardiol，2019，114：18.

[15] Liu H，Wang C，Qiao Z，et al. Protective effect of curcumin against myocardium injury in ischemia reperfusion rats[J]. Pharm Biol，2017，55：1144-1148.

[16] 蔡智慧，尹麗，常全忠. 梔子苷預(yù)處理對H9C2心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響及機制研究[J]. 天津中醫(yī)藥，2016， 33（2）：111-113.

[17] 張會超，徐里，芮浩淼，等. 苦豆堿對缺血再灌注引起的H9C2心肌細胞損傷和炎癥應(yīng)答的作用[J]. 中國病理生理雜志，2018，34（2）：281-286.

[18] 于佳慧，王玲燕，李妍妍，等. 丹參酮ⅡA抑制過度自噬減輕心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷（英文）[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（5）：1689-1694.

[19] Refli Hasan，Dharma Lindarto. The effect of bay leaf extract Syzygium polyanthum （Wight） Walp. on C-reactive protein （CRP） and myeloperoxidase （MPO） level in the heart of rat model of myocardial infarction[J]. Med Glas（Zenica），2020，17（1）：78-82.

[20] 常宏，王勇，李春，等. 益心解毒方抑制H9C2心肌細胞凋亡的作用機制[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，41（1）：25-30.

[21] 霍魁媛. 芪參顆粒調(diào)節(jié)不同環(huán)氧酶亞型COXs介導(dǎo)心肌細胞炎癥損傷作用機理[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016：1-63.

[22] 唐丹麗，石曉雯，周明眉，等. 痰瘀同治方對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞AMPK-mTOP自噬信號通路的影響及機制[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（4）：435-440.

[23] Guo CX，Li ZY，Niu JB，et al. Qishen capsule safely boosts cardiac function and angiogenesis via the MEK/ERK pathway in a rat myocardial infarction model[J]. J Geriatr Cardi，2019，16（10）：764-774.

（收稿日期：2019-12-30）