基于GC-TOF-MS代謝組學(xué)研究高度黑糯米酒后發(fā)酵階段代謝差異

姜 麗,蘇 偉,母應(yīng)春,王洪琳,趙 馳

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

黑糯米又稱紫米,營養(yǎng)價值很高,含有人體所需的多種物質(zhì),具有補血養(yǎng)氣、健脾、促進人體微循環(huán)等多種生理功能,被譽稱為“黑珍珠”[1]。以黑糯米作為原料發(fā)酵釀制的酒晶瑩透明,香氣幽雅悅?cè)?別具一番風(fēng)味[2-3]。黑糯米酒富含蛋白質(zhì)、低聚糖、多肽、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等[4],具有一定的營養(yǎng)價值及保健功能。傳統(tǒng)黑糯米酒的主要特點是乙醇體積分?jǐn)?shù)低和糖分含量高。為了提供更多的選擇,高度黑糯米酒的開發(fā)具有較大市場空間,其生產(chǎn)工藝與低度黑糯米酒不同之處是在后發(fā)酵開始階段用高度基酒調(diào)配之后發(fā)酵而成。然而,后發(fā)酵過程是一個關(guān)鍵的步驟,它極大地改變了酒的化學(xué)成分,隨后改變了酒的風(fēng)味、香氣和生物學(xué)特征[5]。

代謝組學(xué)是以生物樣品中的低分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物(如有機酸、脂肪酸、氨基酸、糖等)為研究對象,通過高通量檢測和數(shù)據(jù)處理,進行信息整合及生物標(biāo)記物鑒定的科學(xué)[6]。作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,代謝組學(xué)能夠檢測出數(shù)十種甚至數(shù)百種內(nèi)源性代謝物,己被廣泛應(yīng)用于食品研究中[7-10]。用于代謝組學(xué)的分析技術(shù)主要有1H-核磁共振、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜等[11]。與其他方法相比,GC-MS成本較低,具有重復(fù)性好、分辨率高、基體效應(yīng)小的優(yōu)點[12],至今仍是代謝組學(xué)研究中的主要分析平臺之一。如Jang等[13]對7 種商業(yè)醋和2 種傳統(tǒng)醋的代謝物譜進行分析,研究表明基于氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(gas chromatography-time of flight-mass spectrometry,GC-TOF-MS)聯(lián)用的代謝物分析有助于了解商業(yè)和傳統(tǒng)醋的代謝物差異。Hao Ruijuan等[14]通過GC-TOF-MS技術(shù)分析不同生長速度的大珠貝母的代謝物變化,并探討了它們不同生長的機制。Zeng Qi等[15]利用GC-TOF-MS技術(shù)對飲食攝入獼猴桃酒后的大鼠代謝指紋圖譜進行研究,揭示獼猴桃酒可能對健康有積極的作用。

然而,目前關(guān)于黑糯米酒的報道主要集中在發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)變化,對發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的差異以及動態(tài)變化的研究較少,尤其是高度黑糯米酒。本研究采用GC-TOF-MS結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法全面描述高度黑糯米酒在后發(fā)酵過程中代謝物的差異,有助于深入了解后發(fā)酵過程中風(fēng)味形成的潛在機制,為高度黑糯米酒工業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

36°高度黑糯米酒取自貴州省惠水縣永紅酒廠;取樣時間2018年9月13日—2019年2月13日,取樣間隔時間1 個月,共6 次(1～6分別代表每次取樣)。

甲醇(色譜純) 美國CNW Technologies公司;氯仿、吡啶(均為色譜純) 中國Adamas公司;甲氧銨鹽(分析純) 日本TCI公司;核糖醇(純度≥99%)美國Sigma公司;雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺(1%三甲基氯硅烷) 美國REGIS Technologies公司;飽和脂肪酸甲酯 德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PEGASUS HT質(zhì)譜儀 美國LECO公司;7890A氣相色譜儀、DB-5MS色譜柱(30 m×250 μm,0.25 μm)美國Agilent公司;Heraeus Fresco17離心機、Forma 900 series超低溫冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司;明澈D24 UV純水儀 美國Merck Millipore公司;PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司;DHG-9023A烘箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TNG-T98真空干燥儀 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 黑糯米酒發(fā)酵工藝流程

黑糯米→洗凈→浸泡→清洗→瀝干→蒸煮→淋飯冷卻→加酒曲(0.5%),拌料→入缸糖化→主發(fā)酵→加水(料液比1∶4(g/mL))→加入基酒(1 kg酒糟∶30 kg基酒)→后發(fā)酵→壓榨→澄清→滅菌→灌裝→成品。

1.3.2 樣品前處理

采集樣品后發(fā)酵總時長6 個月。所有樣品經(jīng)無菌密封后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 理化指標(biāo)的測定

高度黑糯米酒后發(fā)酵過程中的pH值、總糖、還原糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、非糖固形物檢測均參照GB/T 13662—2018《黃酒》[16]測定。

1.3.4 代謝物提取

取100 μL樣本于1.5 mL EP管中,加入300 μL提取液(甲醇),再加入5 μL核糖醇,渦旋30 s;超聲10 min(冰水浴);將樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min;移取30 μL上清液于1.5 mL EP管中,每個樣本各取10 μL混合成QC樣本;在真空濃縮器中干燥提取物;向干燥后的代謝物加入100 μL甲氧胺鹽試劑(甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶20 mg/mL),輕輕混勻后,放入烘箱中80 ℃孵育30 min;向每個樣品中加入100 μL雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺,將混合物70 ℃孵育1.5 h;冷卻至室溫,向混合的樣本中加入5 μL飽和脂肪酸甲酯(溶于氯仿);隨機順序上機檢測。

1.3.5 GC-MS分析

GC條件:DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升溫程序:50 ℃保持1 min,以10 ℃/min升至310 ℃,保持8 min;載氣(He)流速1 mL/min,進樣量1 μL;分流模式:不分流。

MS條件:電子電離源;電子能量-70 eV;進樣口溫度280 ℃;傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度250 ℃;質(zhì)量掃描范圍m/z50～500;掃描速率12.5 光譜/s;溶劑延遲時間6.27 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用ChromaTOF軟件(V 4.3xLECO)對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[17]。對物質(zhì)定性工作中,使用了LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫,包括質(zhì)譜匹配及保留時間指數(shù)匹配。最后將QC樣本中檢出率50%以下或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于30%的峰去除[18]。將得到的數(shù)據(jù)(包括峰數(shù)值,樣品名稱和相對物質(zhì)含量)輸入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析(principal components analysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares-discrimination analysis,OPLS-DA)。使用R2和Q2評估所構(gòu)建的PCA和OPLS-DA模型的質(zhì)量。通過OPLS-DA模型,選擇變量重要性投影(variable importance for the projection,VIP)值大于1的代謝物作為候選差異代謝物。將候選差異代謝物的相對含量進行t檢驗,只有P值小于0.05的代謝物定義為差異代謝物。為進一步闡明差異代謝物的生物學(xué)意義,使用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)模塊,將差異代謝物富集在代謝途徑上,使用超幾何分布法計算富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)分析

表1 高度黑糯米酒后發(fā)酵階段理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indicators of high black glutinous rice wine fermentation stage

由表1可知,總酸含量和pH值在后發(fā)酵過程中呈緩慢上升趨勢?？偹嵩诎l(fā)酵過程中由微生物代謝產(chǎn)生,此外,污染雜菌也會使酸度增加。后發(fā)酵過程中由于乙醇的累積、大分子物質(zhì)的分解及弱堿性(堿性氨基酸 、核苷酸、高級醇等)緩沖物質(zhì)的大量增加,使pH值值緩慢升高[19]。總糖和還原糖含量在后發(fā)酵開始前2 個月變化不大,而在第3個月顯著下降(P＜0.05)。其主要原因在于前發(fā)酵結(jié)束時,發(fā)酵醪中還有部分未水解的淀粉,經(jīng)混勻和裝壇后,發(fā)酵醪中的好氧微生物開始繁殖并水解淀粉,所以后發(fā)酵初期總糖含量變化不大。隨著發(fā)酵時間延長糖類物質(zhì)被降解轉(zhuǎn)化成有機酸、氨基酸等,以及乙醇發(fā)酵的進行而導(dǎo)致總糖含量下降。此外,后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化也呈上升趨勢,文獻[20-21]報道酵母自溶會釋放出蛋白酶A、多肽和氨基酸,因此醪液中的蛋白質(zhì)極有可能在酒曲中的蛋白酶和酵母釋放的酸性蛋白酶雙重作用下被分解,導(dǎo)致酵母的代謝活動減弱,從而利用的氨基酸速率也會減慢,但是酵母自溶會釋放氨基酸[22],使得醪液中氨基酸態(tài)氮含量呈現(xiàn)上升的趨勢。非糖固形物含量隨發(fā)酵時間的延長而降低,可能是進入后發(fā)酵溫度降低,酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇作用減弱,產(chǎn)生其他風(fēng)味成分增加[23],所以非糖固形物含量也開始減少。

2.2 多元統(tǒng)計分析

PCA得分圖的聚散程度反映了樣本代謝物的相近程度,即發(fā)酵過程中代謝物的聚類情況,代謝水平越接近的點在得分圖上越接近[24]。利用SIMCA14.1軟件對不同發(fā)酵時間段的高度黑糯米酒樣本數(shù)據(jù)進行PCA,樣品PCA中R2X為0.867大于0.5表明模型的擬合準(zhǔn)確性好,且得分圖的所有樣品均在95% Hotelling的T2橢圓內(nèi),說明分析的樣品中沒有異常值。由圖1可知,發(fā)酵1、2、4、5、6 個月后的樣本在得分圖上能明顯分開,而發(fā)酵2、3 個月后的樣本在得分圖上區(qū)分不明顯,可能是剛進入后發(fā)酵時加入基酒使得乙醇體積分?jǐn)?shù)升高代謝物變化較大,導(dǎo)致發(fā)酵1、2 個月后的樣本之間存在分離。在此之后,原料中的糖基本上被酵母消耗,同時由于環(huán)境因素和總酸含量增高,酵母的發(fā)酵作用減弱,代謝物變化緩慢,從而導(dǎo)致發(fā)酵2、3 個月后的樣本分離不明顯。隨著發(fā)酵時間的延長,由于代謝物之間的相互作用,產(chǎn)生酯等各種風(fēng)味物質(zhì),導(dǎo)致3、4、5、6 個月后的樣本之間存在明顯分離。

圖1 不同后發(fā)酵時間的PCAFig. 1 Principal component analysis for different post-fermentation times

為了確定不同發(fā)酵階段之間的差異代謝物,進一步使用OPLS-DA模型對樣品進行分類,R2X、R2Y、Q2用于評估OPLS-DA模型的有效性,當(dāng)R2X、R2Y、Q2值越接近于1,說明所構(gòu)建的模型越好[25]。由圖2可知,不同發(fā)酵階段的樣品能夠完全分離,其中每組R2X、R2Y和Q2值分別為(0.867,0.992,0.976)、(0.795,0.995,0.972)、(0.775,0.989,0.823)、(0.921,0.993,0.994)、(0.915,0.994,0.990),說明OPLS-DA模型構(gòu)建成功,具有很高的擬合度和預(yù)測能力,適合探索高度黑糯米酒后發(fā)酵過程中的代謝物差異。

圖2 不同發(fā)酵階段的高度黑糯米酒OPLS-DA得分圖Fig. 2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score map of high black glutinous rice wine in different fermentation stages

2.3 差異代謝物的篩選與分析

基于OPLS-DA模型分析結(jié)果,將VIP值大于1且P值小于0.05的代謝物作為后發(fā)酵階段的差異代謝物,結(jié)果共鑒定出40 種,包括有機酸13 種,氨基酸7 種,糖類及其衍生物11 種,酮類5 種,其他代謝物4 種,結(jié)果如表2所示。代謝物分布可在視覺上分為上調(diào)和下調(diào)[26],為了直觀觀察不同發(fā)酵階段差異代謝物的濃度變化趨勢,依據(jù)每個差異代謝物的相對含量做出熱圖(圖3)。圖3中接近磚紅色表示代謝物含量上調(diào),接近藍色表示代謝物含量下調(diào)。通過圖3可以看到在后發(fā)酵初期代謝物的相對含量較低,隨著發(fā)酵時間的延長代謝物被上調(diào)的逐漸增多。此外發(fā)酵1、4、6 個月的代謝物聚為一類,主要由II區(qū)的代謝物主導(dǎo);而發(fā)酵2、3、5 個月后的代謝物聚為一類,主要由I區(qū)的代謝物主導(dǎo)。

有機酸在酒中既有呈香和呈味作用,同時也可在發(fā)酵過程中抑制雜菌[27-28]。酒中的有機酸一部分來源于酒母或酸度調(diào)節(jié),另一部分來源于米酒發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生。如酵母菌在米酒發(fā)酵過程中能產(chǎn)生琥珀酸,根霉菌產(chǎn)生富馬酸,乳酸菌產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸,這些有機酸各具獨特的風(fēng)味,只有當(dāng)各種有機酸比例相互協(xié)調(diào)時,才能保證米酒的品質(zhì)。本研究在差異代謝物中檢測到的有機酸有草酸、乳酸、琥珀酸、棕櫚酸、硬脂酸等13 種。在發(fā)酵過程中草酸的含量前4 個月變化較小,在發(fā)酵第5個月后達到最高(106.5±7.77)μg/L,發(fā)酵結(jié)束后又下降。乳酸是由丙酮酸通過乳酸脫氫酶產(chǎn)生,乳酸比較柔和,給米酒帶來良好的風(fēng)味,起到增加醇厚感的作用[29]。在發(fā)酵過程中乳酸含量在后發(fā)酵過程呈先下降后升高趨勢,直到發(fā)酵結(jié)束時達到最高(212.97±4.09) μg/L。琥珀酸、棕櫚酸、硬脂酸、2-酮丁酸含量在后發(fā)酵過程中占優(yōu)勢,其中棕櫚酸和硬脂酸為脂肪酸,有研究報道脂肪酸對米酒的風(fēng)味形成有很大的作用[30],它們主要來源于原料。琥珀酸是三羧酸循環(huán)代謝和糖酵解的重要中間產(chǎn)物[31],在后發(fā)酵過程中琥珀酸的含量總體隨發(fā)酵時間延長增加,在發(fā)酵結(jié)束時達到最高(5 800.42±44.65)μg/L。右旋奎寧酸、二十四酸、D-氨基葡萄糖-1-磷酸和3-苯基乳酸的含量變化趨勢一致,均為先上升后下降再上升,且都在6 個月后達到最高。此外,還檢測到果糖-6-磷酸,是生物體內(nèi)的常見分子之一,也是糖酵解過程中所生成的產(chǎn)物之一,屬于酮糖。去氫抗壞血酸是VC在有氧條件下氧化生成,但它容易分解為二酮古洛糖酸,再進一步分解成蘇氨酸和草酸。

氨基酸因其具有的鮮、甜、苦、澀、酸等諸多味感賦予黃酒豐富的味覺層次,使其具有鮮美、柔和、濃郁、柔潤和協(xié)調(diào)的特征[32]。在后酵期間氨基酸的增長可能主要是由微生物細(xì)胞中的氨基酸溶出造成,具有一定的呈味作用,對黑糯米酒的風(fēng)味及感官品質(zhì)的形成具有重要貢獻[33]。從高度黑糯米酒中篩選出的氨基酸差異代謝物有N-乙酰-L-天冬氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、L-別蘇氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、天冬氨酸,其中有2 種是人體必需氨基酸(蛋氨酸和賴氨酸)。在發(fā)酵過程蛋氨酸含量只在發(fā)酵3 個月后檢測到,而賴氨酸的含量相對較高,在發(fā)酵第5個月后達到最高(1 642.82±36.57) μg/L。瓜氨酸在后發(fā)酵過程中含量變化不大,在發(fā)酵6 個月之后達到最高(8 943.64±637.55)μg/L,它是從鳥氨酸及胺基甲酰磷酸鹽在尿素循環(huán)中生成。脯氨酸是甜味氨基酸,在發(fā)酵6 個月后增長為第1個月的1.8 倍。天冬氨酸是20 種蛋白質(zhì)氨基酸之一,和谷氨酸同屬酸性氨基酸[34],在發(fā)酵1 個月后和發(fā)酵6 個月后未檢測到,在發(fā)酵2～4 個月之間變化趨勢是先降低后升高。

糖作為主要的碳源被消耗,通過碳水化合物代謝途徑為微生物的生長提供能量[35]。葡萄糖、果糖、阿洛糖、D-塔洛糖、麥芽三糖等11 種糖類及其衍生物被鑒定為差異代謝物。果糖在后發(fā)酵初期的質(zhì)量濃度為(654.98±40.22) μg/L,到發(fā)酵5 個月后含量達到最高。葡萄糖、景天[酮庚]糖、苯基β-D-葡聚糖、D-塔洛糖在發(fā)酵過程中含量占優(yōu)勢,但葡萄糖在發(fā)酵3 個月后和5 個月后含量急劇下降。景天[酮庚]糖含量隨發(fā)酵時間延長呈上升趨勢,但在發(fā)酵5 個月后未檢出。麥芽三糖和毛地黃毒糖的含量變化趨勢相同,均為先增加后再降低最后再增加,麥芽三糖質(zhì)量濃度在發(fā)酵結(jié)束后最高為(182.1±11.53) μg/L,毛地黃毒糖則是在3 個月后質(zhì)量濃度最高為(294.73±13.14)μg/L。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)肌醇半乳糖苷和甘露醇,它們的含量變化規(guī)律大致相似,且都在3 個月后含量最高。肌醇半乳糖苷的主要生理功能是作為生物合成低聚糖的半乳糖供體,而甘露醇作為抗氧化劑以及不可代替的甜味劑對酒的風(fēng)味有貢獻作用。

酮類物質(zhì)香氣綿柔細(xì)膩,能帶給酒體愉快的香氣。在差異代謝物中含量占優(yōu)勢的是7-羥基-4-雄甾烯-3,17-二酮和9-芴酮,它們都在第5個月時質(zhì)量濃度最高分別達到(767.14±10.65)μg/L和(648.22±37.05)μg/L。除此之外二聚丙三醇、甘油磷酸、順-1,2-二氫苯基-1,2-二醇、3-丙酸尿苷也被鑒定為差異代謝物,二聚丙三醇的含量在發(fā)酵第4個月達到最高后開始下降,但變化不大。順-1,2-二氫苯基-1,2-二醇的含量先上升到第3個月達到峰值后開始下降,在第5個月又緩慢上升。而整個后發(fā)酵過程中甘油磷酸只在第4個月檢測到,3-丙酸尿苷只在第1個月檢測到。

表2 高度黑糯米酒后發(fā)酵階段差異代謝物含量Table 2 The relative contents of differential metabolites in the post-fermentation stage of high black glutinous rice wine

圖3 高度黑糯米酒后發(fā)酵階段差異代謝物熱圖和聚類圖Fig. 3 Heat map of differential metabolites and cluster map of high black glutinous rice after fermentation

2.4 關(guān)鍵代謝途徑分析

圖4 差異代謝物通路富集分析Fig. 4 Enrichment analysis of differential metabolite pathways

圖5 差異代謝物代謝途徑分析Fig. 5 Metabolic pathway analysis of differential metabolites

為了探索高度黑糯米酒后發(fā)酵階段潛在代謝途徑,使用MetaboAnalyst 4.0進行差異代謝物的代謝途徑分析,由圖4可知,通路分析結(jié)果顯示共獲得26 個途徑,基于影響值大于0.01對關(guān)鍵代謝途徑進行篩選[36],結(jié)果發(fā)現(xiàn)有8 條關(guān)鍵代謝途徑。這些途徑包括甘油脂代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、谷氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、甘油磷脂代謝,影響值分別為0.281 25、0.134 08、0.048 8、0.043 54、0.122 55、0.023 83、0.039 74、0.068 48。

如圖5所示,8 條關(guān)鍵代謝途徑中主要參與的差異代謝物主要有天冬氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、2-酮丁酸、果糖、葡萄糖、3-磷酸甘油、二羥基丙酮和琥珀酸。發(fā)酵過程中首先是原料中的淀粉水解成葡萄糖和果糖,在糖酵解途徑中葡萄糖在葡萄糖激酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖,再經(jīng)果糖-6-磷酸激酶-1、醛縮酶、磷酸丙酮異構(gòu)酶、丙酮酸激酶等酶作用下生成丙酮酸進入三羧酸循環(huán)。然而,在甘油磷脂代謝途徑中首先由原料中的脂肪降解成甘油,甘油被認(rèn)為是酵母乙醇發(fā)酵中最重要的副產(chǎn)物,幫助細(xì)胞適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件。隨后甘油在甘油激酶的而作用下可生成3-磷酸甘油,接著在磷酸甘脫氫酶作用下生成磷酸二羥丙酮,在轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油醛從而經(jīng)糖酵解途徑進入三羧酸循環(huán)。2-酮丁酸可在谷氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中由蘇氨酸轉(zhuǎn)變而來,2-酮丁酸具有刺激性氣味,可以在乙酰羧酸合成酶催化作用下生成異亮氨酸的前體乙酰羥基丁酸,有助于異亮氨酸合成[37]。天冬氨酸和蛋氨酸分別在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及半胱氨酸和甲硫氨酸代謝代謝途徑中生成。脯氨酸是谷氨酸的前體,與瓜氨酸一樣在精氨酸和脯氨酸代謝途徑中生成,這些氨基酸均可在酶的作用下進入三羧酸循環(huán)有助于一些有機酸生成,共同助力黑糯米酒風(fēng)味的形成。

3 結(jié) 論

本研究采用化學(xué)方法和GC-TOF-MS技術(shù)對高度黑糯米酒后發(fā)酵階段的理化指標(biāo)以及代謝物進行監(jiān)測分析。結(jié)果表明,高度黑糯米酒后發(fā)酵階段總酸,pH值和氨基酸態(tài)氮含量呈上升趨勢,而總糖、還原糖和非糖固形物則相反。通過PCA結(jié)果發(fā)現(xiàn),高度黑糯米酒在發(fā)酵1、4、5、6 個月之后的樣品存在明顯的分離,這種分離表明這些代謝物有著顯著的差異;然而,發(fā)酵2、3 個月后的樣品之間分離不明顯,說明代謝物變化較小。OPLSDA結(jié)果表明,后發(fā)酵階段差異代謝物共有40 種。使用MetaboAnalyst 4.0對40 種差異代謝物的代謝通路進行分析發(fā)現(xiàn)28 條代謝途徑與高度黑糯米酒后發(fā)酵有關(guān),其中有8 條被鑒定為關(guān)鍵代謝途徑。本研究有助于了解高度黑糯米發(fā)酵后過程中的代謝產(chǎn)物的差異及其變化,因此可根據(jù)發(fā)酵過程中有機酸、糖類、氨基酸等生物活性物質(zhì)的含量變化確定發(fā)酵過程的發(fā)酵周期,為高度黑糯米酒的生產(chǎn)和開發(fā)提供一定的技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。