大豆親脂蛋白組分分析及體外抗氧化特性

曾劍華,劉琳琳,楊 楊,張 娜,朱秀清,*,石彥國(guó),*,鄭環(huán)宇,王新越

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150076;2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江 哈爾濱 150028)

大豆是世界上主要的油料作物之一,是優(yōu)質(zhì)植物蛋白重要來(lái)源,大豆干基中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為40%[1]。近年來(lái)一種新型大豆蛋白組分被分離鑒定。Samoto等[2]首次通過(guò)3 次酸沉分離出磷脂含量約為10%的高脂蛋白——大豆親脂蛋白(soy lipophilic protein,SLP),并大致確定了11S球蛋白、SLP和7S球蛋白在大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)中的占比為4∶3∶2。這一發(fā)現(xiàn)改變了之前認(rèn)為SPI主要由11S球蛋白和7S球蛋白組成的認(rèn)識(shí)[3-4]。

SLP因其磷脂含量高而備受關(guān)注[5-6],目前對(duì)SLP的功能特性己有研究報(bào)道,如Sirison等[6]研究發(fā)現(xiàn)大豆蛋白組分中,SLP的溶解性較差;Urade等[4]研究表明SLP具有降低血液膽固醇和三?；视偷淖饔?Gao Zhiming等[7]研究顯示SLP可作為潛在的乳化劑;并發(fā)現(xiàn)SLP納米顆粒能作為輸送共軛亞油酸的良好載體,具有荷載量高、緩釋和抗氧化的特性[5]。近年來(lái),關(guān)于蛋白的抗氧化研究受到越來(lái)越多關(guān)注,如研究發(fā)現(xiàn)磷蝦脂蛋白具有降低膽固醇、降血糖活性和抑制脂肪生成功能的同時(shí)[8-9],還具有良好的抗氧化等作用[10-11];Faraji等[12]研究顯示清蛋白、酪蛋白、SPI具有清除氫過(guò)氧化物的效果,表明在食物基質(zhì)中添加一定量的蛋白能夠抑制氧化反應(yīng)起到保護(hù)不飽和脂肪酸的作用。目前關(guān)于SLP的生物活性功能研究較少;且對(duì)SLP的具體成分分析尚停留在蛋白種類和氨基酸組成以及磷脂種類組成上[13-14],對(duì)其具體的脂肪酸組成和SLP的抗氧化活性研究更是鮮有報(bào)道;因此有必要對(duì)SLP的氨基酸、脂肪酸等組成成分進(jìn)行分析,為進(jìn)一步開(kāi)展的抗氧化活性等功能研究提供理論參考。

本實(shí)驗(yàn)以冷榨豆粕為原料,經(jīng)過(guò)3 步酸沉分離制備SLP;通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳、薄層色譜、氨基酸自動(dòng)分析儀和氣相色譜對(duì)SLP的組成成分進(jìn)行分析;在此基礎(chǔ)上以1,1-二苯-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、羥自由基、2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽(yáng)離子自由基和鐵還原力為評(píng)價(jià)指標(biāo),研究SLP的體外抗氧化能力;為專用型大豆蛋白組分——SLP的制備及其在食品工業(yè)開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨豆粕 黑龍江鶴旭食品有限公司;低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、牛血清蛋白、磷脂酰膽堿(phosphatidyl choline,PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)上海索萊寶生物科技有限公司;37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;正己烷、三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)metyl aminomethane,Tris)、氯仿、甲醇、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過(guò)硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R250、甲醇、冰醋酸、甘氨酸、尿素、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)、溴化鉀、溴酚藍(lán)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳儀 北京六一生物科技有限公司;HF254硅膠板上海康朗生物科技有限公司;S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀 德國(guó)賽卡姆(北京)科學(xué)儀器有限公司;Nano-ZS-90馬爾文激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司;DSC-4000差示量熱掃描儀、Spectrum Two傅里葉變換近紅外光譜儀、LAMBDA 365紫外光譜儀 美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司;ALPHA1650型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司;F-7000熒光光譜儀日本日立儀器(上海)有限公司;GC 7900氣相色譜儀上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SLP樣品制備

通過(guò)3 步酸沉依次分離出11S球蛋白(pH 6.4)、SLP(pH 5.2)和7S球蛋白(pH 4.5),具體步驟如下:冷榨豆粕用0.5 mol/L pH 8.5的Tris-HCl緩沖液,55 ℃水浴提取60 min,經(jīng)4 000 r/min離心20 min,取上清液,將上清液pH值調(diào)至6.4后靜置30 min,4 000 r/min離心20 min分離出沉淀即為11S球蛋白;取上清液調(diào)pH值至5.2后靜置30 min后,將pH值調(diào)回5.5,4 000 r/min離心20 min分離出沉淀即為SLP;取上清液調(diào)pH值至4.5后靜置30 min,4 000 r/min離心20 min分離出沉淀即為7S球蛋白。各組分沉淀用適量去離子水溶解并將pH值調(diào)至7,透析48 h后,冷凍干燥備用。

1.3.2 SLP理化性質(zhì)測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法;灰分的測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》;水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》。

總脂含量測(cè)定參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》并稍作修改。將2.000 g SLP樣品用石油醚索氏抽提4 h,然后真空干燥并固化稱質(zhì)量計(jì)算總脂含量。將提取的油脂用于脂肪酸成分分析。

1.3.3 巰基二硫鍵測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13-14]方法測(cè)定。

1.3.4 表面疏水性測(cè)定

參考Kato等[15]的方法,采用1-苯胺基-8-萘磺酸熒光探針?lè)y(cè)定疏水性。用pH 7 PBS配制2 mg/mL的蛋白樣品溶液,并稀釋成不同質(zhì)量濃度梯度(0.02～1 g/mL)的蛋白樣品溶液。測(cè)試前,取2 mL樣品液加入20 μL 8 mmol/L 8-苯胺-1-萘磺酸,搖勻,靜置3 min;在狹縫5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)520 nm測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度;以20 μL 8-苯胺-1-萘磺酸+2 mL PBS作空白。

1.3.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

將樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液,取0.5 mL樣品溶液加入0.5 mL樣品緩沖液(0.2 mL 10% SDS和50 μL 0.01 mol/L的β-巰基乙醇)混勻后,于100 ℃煮沸10 min后上樣,上樣量為20 μL。采用濃縮膠體積分?jǐn)?shù)5%、分離膠體積分?jǐn)?shù)12%,電壓恒定為120 V。膠板用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,用甲醇-冰醋酸溶液脫色后,掃描凝膠,用Imagequant TL8.0.1軟件分析凝膠圖譜[16]。

1.3.6 薄層色譜分析

參照Samoto等[4]方法測(cè)定。

1.3.7 氨基酸成分測(cè)定

采用S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀參照Ursu等[17]方法進(jìn)行,樣品在6 mol/L HCl、110 ℃條件下酸解22 h后過(guò)濾上樣,結(jié)果取2 次平均值。

蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)采用FAO/WHO氨基酸評(píng)分評(píng)價(jià),以被評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)中某種必需氨基酸與FAO/WHO提供的參考蛋白質(zhì)中該種氨基酸的含量比值計(jì)算必需氨基酸評(píng)分(amino acid score,AAS),最低分即為該蛋白質(zhì)的AAS[18]。

1.3.8 脂肪酸成分分析

取1.3.2節(jié)中SLP脂質(zhì)用1.0 mL正己烷溶解,加入2 mL 0.5 mol/L甲醇鈉溶液(稱1.999 8 g NaOH溶于100 mL甲醇,磁力攪拌助溶)靜置30 min,12 000 r/min離心2 min后,取上層有機(jī)相進(jìn)行氣相色譜分析。

GC測(cè)試條件:色譜柱:Agilent DB-Fast FAME(30 m×0.25 mm,0.25 μm);手動(dòng)不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量3 μL;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣為氮?dú)?54 mL/min)、氫氣(40 mL/min)、空氣(400 mL/min)。升溫程序:80 ℃保持0.5 min;40 ℃/min升至165 ℃,保持1 min;4 ℃/min升至230 ℃,保持4 min。檢測(cè)器:火焰離子檢測(cè)器,溫度為260 ℃。

1.3.9 抗氧化性研究

羥自由基清除能力測(cè)定:參考胡玲玲等[19]方法。取0.5 mL樣品于比色管中,分別加入0.5 mL 9.1 mmol/L硫酸亞鐵溶液、5 mL 8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液和0.5 mL 9.1 mmol/L水楊酸-無(wú)水乙醇溶液,用去離子水定容至10 mL,于37 ℃水浴中靜置30 min,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)式(1)計(jì)算羥自由基清除率:

式中:A0為加蒸餾水溶液的吸光度;A1為加樣品溶液的吸光度;A2為未加硫酸亞鐵溶液的吸光度。

ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性測(cè)定:參考林春通等[20]方法。將0.007 4 mol/L ABTS溶液與0.002 mol/L過(guò)硫酸鉀溶液以1∶0.5的體積比混合在室溫下在避光放置12～16 h。測(cè)定前,用pH 7.4的PBS將ABTS溶液稀釋至吸光度(0.700±0.020)。將100 μL樣品溶液與3.9 mL稀釋的ABTS溶液混合,37 ℃反應(yīng)5 min后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A4,以PBS作為空白。平行測(cè)定3 次,根據(jù)式(2)計(jì)算ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率:

式中:A3為空白組溶液的吸光度;A4為加樣品溶液的吸光度。

DPPH自由基測(cè)定:參照Nicklisch等[21]的方法稍作修改。取0.5 mL樣品溶液加入3.3 mL含有1%吐溫20的檸檬酸/PBS(0.1 mol/L,pH 7),最后加入0.2 mL 2 mmol/L的DPPH甲醇溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)使得DPPH最終濃度為0.1 mmol/L,在黑暗處反應(yīng)2 h后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,分別以0.1 mol/L pH 3的檸檬酸/PBS和去離子水作空白對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算如式(3)所示:

式中:AS0和AC0為樣品和緩沖液初始吸光度(3～5 min);AS1和AC1為樣品和緩沖液反應(yīng)2 h后的吸光度。

還原能力測(cè)定:參照胡玲玲等[19]方法。將1 mL樣品與9 mL去離子水混合,然后Whatman paper No. 1濾紙過(guò)濾后,加入3 mL FRAP試劑(0.3 mol/L 100 mL pH 3.6乙酸鈉緩沖液、10 mmol/L溶于40 mmol/L HCl的TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3以10∶1∶1體積比混合),在37 ℃反應(yīng)30 min。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)量混合物的吸光度。還原能力計(jì)算如式(4)所示:

式中:A5為未加樣品溶液的吸光度;A6為加樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 SLP特征

由表1可知,4 個(gè)蛋白組分中,SPI、11S和7S球蛋白蛋白純度基本達(dá)到90%,而SLP蛋白含量為76.23%,且SLP總脂含量(以磷脂計(jì))最大為12.14%。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得SLP的總脂含量比Samoto等[2]測(cè)定的11.4%和Gao Zhiming等[5]測(cè)得的7.4%高,這可能是由于本研究中SLP的制備方法較前者有改進(jìn)。尹利昂等[22]研究也表明,不同的磷蝦脂蛋白制備方法得到的磷蝦富脂蛋白中磷蝦油和蛋白組成不同。

表1 理化指標(biāo)分析（干基）Table 1 Physicochemical indexes of soy proteins (dry basis)%

圖1 不同蛋白組分薄層色譜（a）和聚丙烯酰胺凝膠電泳譜（b）Fig. 1 TLC (a) and SDS-PAGE patterns (b) of soy proteins

如圖1a所示,SLP中含有的主要脂質(zhì)成分分別為PE、PC和PI,11S球蛋白含有少量的PC和PE,7S球蛋白基本不含有磷脂成分,這可能是因?yàn)镾LP疏水性最大,易于和磷脂結(jié)合,而7S球蛋白表面疏水性低,因此7S球蛋白與磷脂結(jié)合能力低。這與Samoto[2]和Gao Zhiming[5]等的研究結(jié)果一致。

如圖1b所示,SLP蛋白條帶類型和SPI類似,這與Samoto[2]和Gao Zhiming[5]等的研究結(jié)果一致,均為11S和7S球蛋白構(gòu)成,還含有分子質(zhì)量為17、18、24、34 kDa的特征蛋白條帶的膜蛋白分子。研究表明,蛋白-磷脂共存物對(duì)考馬斯亮藍(lán)敏感度低,導(dǎo)致SLP蛋白條帶與SPI、11S和7S球蛋白相比灰度值偏低[6]。本實(shí)驗(yàn)增大蛋白上樣濃度后,能清晰觀察到SLP的典型特征蛋白條帶,可以推斷本實(shí)驗(yàn)制備的SLP具有現(xiàn)有文獻(xiàn)記載的典型特征,是一種富含磷脂成分的SLP。

2.2 巰基、二硫鍵含量與表面疏水性分析

圖2 不同蛋白組分巰基和二硫鍵含量對(duì)比分析Fig. 2 Comparative analysis of sulfhydryl and disulfide bonds contents in different soy proteins

由圖2可知,游離巰基、總巰基和二硫鍵最高的為11S球蛋白,其次是SLP和SPI,7S球蛋白含量最少;這可能與11S球蛋白和7S球蛋白組分比例有關(guān),研究表明11S球蛋白分子中含有2 個(gè)半胱氨酸和2 個(gè)胱氨酸殘基,高于7S球蛋白中半胱氨酸含量(1 個(gè))[23];這與Tang Chuanhe[24]和Ma Wenjun[25]等的研究結(jié)果一致,大豆蛋白組分中11S球蛋白中總巰基和二硫鍵含量較高。SLP中游離巰基、總巰基和二硫鍵含量分別為5.05、11.90、3.42 μmol/g,與SPI含量最接近,這可能是因?yàn)槎呔鶠?1S和7S主要球蛋白組成,含量不完全相近可能是11S和7S球蛋白構(gòu)成比例不同造成的。游離巰基與總巰基的比值一定程度反映了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊程度,比值越小,蛋白折疊程度越高,其中SLP比值最小,表明其具有緊湊的三級(jí)結(jié)構(gòu)[26]。

圖3 不同蛋白組分表面疏水性對(duì)比分析Fig. 3 Comparative analysis of hydrophobicity of different soy proteins

表2 SPI、SLP、11S和7S球蛋白氨基酸組成及氨基酸評(píng)分Table 2 Amino acid compositions and AAS of SPI, 11S, 7S and SLP

由圖3可知,不同蛋白組分中表面疏水性最大的為SLP(305.19),其次為SPI(173.89),11S和7S球蛋白分別為166.72和147.64。Sirison等[6]研究表明7S和11S球蛋白的溶解度最大,其次是SPI,而SLP的溶解度最小,有研究顯示蛋白表面疏水性和溶解度成負(fù)相關(guān),與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[15]。2.1節(jié)研究結(jié)果表明,SLP含有大量磷脂,具有強(qiáng)烈的疏水相互作用,是其表面疏水性較大的原因;另外,由2.1節(jié)表2中SPI、SLP、11S和7S球蛋白氨基酸含量分析可知,SLP和SPI中疏水性氨基酸含量最高,7S和11S疏水性氨基酸含量最少,這與SPI、SLP、11S和7S球蛋白的表面疏水性結(jié)果一致。

2.3 氨基酸組成分析

如表2所示,與植物蛋白組成類似,SLP中酸性氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)含量最高;SLP具有豆科類蛋白典型特點(diǎn),即含硫氨基酸含量偏低(甲硫氨酸、半胱氨酸)[5,27];SLP的氨基酸組成和SPI、11S和7S球蛋白總體分布相似,但SLP的丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸含量較高,谷氨酸含量較低。由表2中FAO/WHO提供的必需氨基酸參數(shù)可知,除了甲硫氨酸,SLP能夠滿足學(xué)前兒童、兒童和成年人的日需求量。同時(shí)由氨基酸評(píng)分可知SLP的AAS最大,說(shuō)明SLP比SPI、11S和7S球蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值要高,且SLP的AAS分布在60～100之間,相比11S和7S球蛋白而言,氨基酸比例比較均衡。

根據(jù)Sharma等[28]提出的具有抗氧化性的芳香族氨基酸、含硫氨基酸、組氨酸和脯氨酸等歸為功能性氨基酸,由表2可知,SLP的功能性氨基酸含量最大,為17.11 g/100 g,表明SLP具有一定的抗氧化能力。

研究表明,蛋白質(zhì)中精氨酸和賴氨酸的比值越大,具有降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用可能性越強(qiáng)[29];由表2可知,11S和7S球蛋白的精氨酸和賴氨酸的比值均大于1,基本符合目前報(bào)道的Arg/Lys比值范圍(1.4～5.5);SLP中比值最大為1.58,表明SLP在預(yù)防心血管疾病方面具有更好的效果[29-30]。人體骨骼肌中含有60%～75%的蛋白質(zhì),而這些蛋白中的必需氨基酸中有35%是支鏈氨基酸,因此補(bǔ)充支鏈氨基酸對(duì)健身愛(ài)好者至關(guān)重要。SLP的支鏈氨基酸含量最高為16.44 g/100 g,其異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸的比值(亮氨酸-異亮氨酸-纈氨酸＝1∶0.56∶0.65)符合當(dāng)前研究推薦的攝入比例(亮氨酸-異亮氨酸-纈氨酸=1∶0.56∶0.67)[31-33]。

綜上所述,SLP組分可作為功能性蛋白在抗氧化、預(yù)防心血管疾病和增肌方面具有潛在的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

2.4 脂肪酸組成分析

37 種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和SLP總脂甲酯化后的氣相色譜圖見(jiàn)圖4,對(duì)比脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的保留時(shí)間,共分離鑒定出27 種脂肪酸。由表3可知,SLP脂質(zhì)成分中主要成分為不飽和脂肪酸,占總脂肪酸的66.55%,主要由油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等組成,其中單不飽和脂肪酸含量為24.82%,多不飽和脂肪酸含量為41.73%;飽和脂肪酸含量為33.45%,主要為己酸、棕櫚酸、十七碳酸、硬脂酸以及少量的豆蔻酸等組成,與鮑風(fēng)等[34]磷脂組分的研究結(jié)果相比,其不飽和脂肪酸含量略低(71.53%)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要脂肪酸為中長(zhǎng)碳鏈脂肪酸,出現(xiàn)短鏈脂肪酸可能是脂肪酸甲酯化過(guò)程中水解過(guò)度所致。研究顯示,大豆磷脂主要成分為PC、PE、PI、甘油磷脂以及少量的溶血磷脂,SLP脂質(zhì)中的花生酸和二十二碳烯酸可能來(lái)源于溶血膽堿磷脂[33]。本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的反式脂肪酸主要為順式脂肪酸的同分異構(gòu)體,占SLP含量約為1.34%,出現(xiàn)的原因可能是冷榨過(guò)程中局部擠壓高溫造成。

圖4 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品和SLP脂肪酸氣相色譜圖Fig. 4 Gas chromatogram profiles of fatty acid standards and SLP fatty acids

表3 SLP脂肪酸組成分析Table 3 Fatty acid composition of SLP

2.5 SLP體外抗氧化特性分析

本研究根據(jù)SLP組分具有較高的疏水特性和組成特性,以及根據(jù)生物體組織內(nèi)存在的最活躍的活性氧(羥自由基),選取具有特異選擇性的ABTS陽(yáng)離子自由基、非特異性選擇性的羥自由基、穩(wěn)定性最好的DPPH自由基以及鐵還原力考察SLP對(duì)特定自由基的清除能力、穩(wěn)定性和與金屬離子的螯合能力[35-37],從而評(píng)價(jià)SLP的抗氧化特性。

由圖5可知,SPI、SLP、11S和7S球蛋白對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基、DPPH自由基、羥自由基和鐵離子都有一定的清除能力和還原力;自由基清除率和鐵還原能力對(duì)蛋白質(zhì)量濃度有依賴性,都隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大而增大;在同一濃度條件下,SLP的自由基清除能力和鐵還原力均優(yōu)于SPI、11S和7S球蛋白的抗氧化效果,這與SLP的特殊氨基酸構(gòu)成和富含磷脂有著密切關(guān)聯(lián)。

圖5 大豆蛋白對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基（A）、DPPH自由基（B）、羥自由基（C）的清除效果和鐵還原能力（D）Fig. 5 Scavenging effects of soy proteins on ABTS cation radical(A), DPPH radical (B), hydroxyl radical (C) and their ferric reducing antioxidant power (D)

由圖5A可知,在低蛋白質(zhì)量濃度條件下(2 mg/mL),SLP和11S球蛋白的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率(51.90%和49.66%)顯著高于SPI和7S自由基清除效果(11.55%和15.71%),且基本上SLP和11S球蛋白的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力相當(dāng)。研究表明功能性氨基酸中對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基具有清除效果的半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸,抗氧化能力分別為6 600.57、186.29、173.96 mmol/kg,因而其主要作用的是半胱氨酸[34],由2.3節(jié)研究結(jié)果可知,SLP和11S球蛋白中半胱氨酸和酪氨酸含量最大。且?ili?等[35]研究表明,ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力與二硫鍵含量成正比,本研究表明,SLP和11S球蛋白中二硫鍵含量最大,因而SLP和11S球蛋白具有較高的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力;而7S球蛋白中半胱氨酸、酪氨酸和二硫鍵含量最小,這可能導(dǎo)致其ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最小。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果推斷ABTS陽(yáng)離子自由基清除率與二硫鍵含量呈顯著正相關(guān)(R=0.905,P＜0.05)。而研究發(fā)現(xiàn)ABTS陽(yáng)離子自由基測(cè)試適用于疏水性抗氧化劑,也適用于親水性抗氧化劑,因而樣品表面疏水性對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率無(wú)線性關(guān)系。

DPPH自由基具有優(yōu)異的穩(wěn)定性,能接受質(zhì)子和電子形成穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu),因而DPPH自由基清除測(cè)試應(yīng)用最高的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)[36]。由圖5B可知,在低質(zhì)量濃度蛋白條件下(2 mg/mL),SLP和SPI的DPPH自由基清除能力(64.88%和60.52%)顯著優(yōu)于11S和7S球蛋白的自由基清除能力(52.58%和50.01%);隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大DPPH自由基清除率逐漸趨于平穩(wěn)。使用改良的DPPH自由基測(cè)試方法,既保證疏水性的DPPH能充分溶解,又避免了傳統(tǒng)方法(只有甲醇或乙醇)造成蛋白變性或不溶。本實(shí)驗(yàn)中DPPH自由基清除率效果最佳的是SLP,可能是因?yàn)榧尤胗袡C(jī)溶劑后促進(jìn)了SLP中磷脂成分的溶解。由2.4節(jié)可知SLP種不飽和脂肪酸占總脂的66.55%,從而增加了DPPH自由基清除的能力;而SPI中也含有微量脂質(zhì)成分,與11S和7S球蛋白相比,DPPH自由基清除能力有所增大。

相比ABTS陽(yáng)離子自由基和DPPH自由基而言,羥自由基具有非特異選擇性,也是生物系統(tǒng)中與細(xì)胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸分子發(fā)生反應(yīng)并對(duì)細(xì)胞造成損傷的最活躍的一種活性氧[35]。由圖5C可知,在低蛋白質(zhì)量濃度條件下(2 mg/mL),SLP對(duì)羥自由基清除率(57.25%)極顯著(P＜0.01)高于SPI、11S和7S球蛋白對(duì)羥自由基的清除能力(分別為13.76%、19.6%和24.23%);隨著質(zhì)量濃度增加,7S球蛋白和SPI對(duì)羥自由基的清除能力要由于11S球蛋白對(duì)羥自由基清除效果。SLP因其富含磷脂成分,磷脂中不飽和脂肪酸約為66.55%,且功能性氨基酸含量最大,因此,非特異性的羥自由基測(cè)試中,SLP測(cè)試效果最佳。而7S球蛋白實(shí)質(zhì)上是糖蛋白,有研究表明糖蛋白對(duì)羥自由基的清除效果要由于DPPH自由基清除效果[37],與本研究結(jié)果相符。

蛋白可以和金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)從而達(dá)到控制氧化反應(yīng)的作用,鐵還原能力是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)與金屬離子螯合能力強(qiáng)弱程度。如圖5D所示,在低蛋白質(zhì)量濃度條件下(2 mg/mL),SLP的鐵還原能力最強(qiáng)(67.19%),隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大,SLP、SPI、11S和7S球蛋白的鐵還原能力逐漸增大后趨于不變。研究表明除如轉(zhuǎn)鐵蛋白等特異專一性蛋白外,一些富含組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸以及磷酸化絲氨酸側(cè)鏈的非特異性蛋白質(zhì)也具有鐵還原能力,如乳清蛋白、酪蛋白、SPI等[12],這些蛋白不具備儲(chǔ)藏和轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的能力,但它們能通過(guò)蛋白表面的組氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和及磷酸化絲氨酸以及疏水核心和鐵離子螯合,將具有三價(jià)鐵離子還原成二截鐵離子并儲(chǔ)存在蛋白的螺旋折疊結(jié)構(gòu)中,從而達(dá)到抑制食物的氧化。在本實(shí)驗(yàn)中,SLP因其具有較高的螯合氨基酸含量和表面疏水性而對(duì)鐵還原能力最強(qiáng),其次是SPI,7S球蛋白因螯合氨基酸含量低,且表面疏水性低,而具有較弱的鐵還原力。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳、氨基酸自動(dòng)分析儀和氣相色譜分別研究SLP的蛋白組分、氨基酸和脂肪酸組成;在此基礎(chǔ)上以DPPH自由基、羥自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和鐵還原抗氧化能力為評(píng)價(jià)SLP的抗氧化特性。結(jié)果表明,SLP中精氨酸和賴氨酸比值最大為1.58,富含支鏈氨基酸(16.44 g/100 g),且SLP氨基酸評(píng)分最大;脂肪酸成分分析表明,SLP脂質(zhì)成分含有27 種脂肪酸,不飽和脂肪酸占總脂的66.55%,與SPI、11S和7S球蛋白相比,SLP具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值潛力。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與SPI、11S和7S球蛋白相比,因SLP中的半胱氨酸、酪氨酸和二硫鍵含量較高,且富含磷脂成分以及含有較大的疏水核心,SLP表現(xiàn)出良好的DPPH自由基、羥自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除效果和鐵還原能力。本研究為SLP在抗氧化等領(lǐng)域應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。