辣根過氧化物酶催化阿魏酸交聯(lián)果膠物化特性

劉延照,李 想,劉功繼,李 潔,2,嚴(yán)守雷,2,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070;2.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430070)

阿魏酸是一種羥基肉桂酸,屬于酚酸類物質(zhì)。阿魏酸在植物細(xì)胞壁中廣泛存在,是細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分[1]。按結(jié)構(gòu)分為順式和反式2 種,植物細(xì)胞壁中絕大多數(shù)為反式阿魏酸,呈纖維狀結(jié)晶;順式阿魏酸為黃色油狀物,自然界中含量較少[2]。阿魏酸具有多種生理功能,如抗炎、抗病毒、抗輻射、抗細(xì)胞凋亡、抗癌等,具有很好的生理保健作用[3]。阿魏酸在食品工業(yè)中有多種應(yīng)用,可作為天然食品防腐劑,抑制脂肪酸的過氧化[4],抑制微生物的生長[5]。此外,富含阿魏酸的多糖在過氧化物酶和過氧化氫存在下會(huì)發(fā)生凝膠化,利用這一性質(zhì)可以使多糖凝膠化制備食品膠[6-7]。

果膠的分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,其中最豐富的結(jié)構(gòu)域是同型半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan,HG)和鼠李糖半乳糖醛酸(rhamnogalacturonan,RG)[8]。HG是一條由α-1,4鍵連接的線性半乳糖醛酸鏈,植物中的HG在C-3位可以被甲基化,在O-2或O-3位可被乙?；痆9]。RG-I型果膠的主鏈由(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-D-GalA重復(fù)組成,主鏈一部分的鼠李糖殘基被中性和酸性低聚糖取代,側(cè)鏈的組成主要為阿拉伯糖和半乳糖[10],RG-I上的半乳糖醛酸可乙?；?卻不可能存在甲基化[11]。RG-II的主鏈?zhǔn)荋G,其側(cè)鏈包含4 個(gè)不同的低聚物側(cè)鏈。

研究表明,阿魏酸在酶催化條件下,能與果膠、淀粉、殼聚糖等分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),可以有效提高果膠的乳化性和抗氧化性[12],提高淀粉溶脹力[13],改善殼聚糖的結(jié)構(gòu)和緩釋性能[14]。有研究表明在甜菜細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)阿魏酸殘基酯可以與果膠的阿拉伯糖和半乳糖側(cè)鏈相連[15],這種聯(lián)系可能是通過阿拉伯糖鏈α-1,5-阿拉伯糖單元的O-2和半乳糖鏈β-1,4-半乳糖單元的O-6發(fā)生[16],其中阿魏酸酯可能由于細(xì)胞壁中的氧化反應(yīng)而形成脫氫二聚體[15]。在Oosterveld等[17]的研究中,過氧化氫和過氧化物酶被應(yīng)用于甜菜果膠的氧化交聯(lián)后,觀察到阿魏酸單體量的減少和脫氫二亞硫酸鹽的增加,Ishii[18]發(fā)現(xiàn)RG-I的阿拉伯聚糖支鏈可通過阿魏酸的氧化反應(yīng)形成交聯(lián)。由于天然的甜菜果膠中大約含有50%～60%的阿魏酸[19],因此很多研究將甜菜果膠作為研究對象,利用蟲漆酶或辣根過氧化物酶等對其改性,可有效促進(jìn)果膠的凝膠化[20],增大果膠分子質(zhì)量并增強(qiáng)了乳液穩(wěn)定性[21-22],提高了果膠茹度等性質(zhì)[23],但在白蘿卜中鮮見類似報(bào)道,通過實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)[24],阿魏酸處理白蘿卜會(huì)對其細(xì)胞壁中的果膠產(chǎn)生影響。因此本實(shí)驗(yàn)將白蘿卜中的果膠提取出來,用阿魏酸和辣根過氧化物酶對果膠進(jìn)行改性處理,并對相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行測定,為改善果膠的功能性質(zhì)、確定阿魏酸處理影響果膠性質(zhì)的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蘿卜購于武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場,品種為長羽裂蘿卜,經(jīng)過冷凍干燥后用于果膠的提取和相關(guān)性質(zhì)的測定。

阿魏酸(反式)、辣根過氧化物酶(標(biāo)定酶活力為300 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;乙醇、甲醇、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、VC(均為分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、透析袋(3 500 Da) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UitraScan XE色度測定儀 美國Hunterlab公司;Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國梅特勒-托利多公司;UV-1750紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司;DHR2流變儀 美國沃特斯公司;LGJ-30F真空冷凍干燥機(jī) 北京松原華興科技發(fā)展有限公司;HH-2恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;BSA124S分析天平 德國賽多利斯集團(tuán);R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司;GM-0.22A隔膜真空泵 中國津騰公司;SU-8010掃描電鏡 日本株式會(huì)社日立制作所;Sorvall ST16R高速離心機(jī) 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 白蘿卜果膠的提取與改性

1.3.1.1 白蘿卜果膠的提取

參考彭小燕等[25]的提取方法,略有改動(dòng)。取烘干的白蘿卜醇不溶組分粉末10 g,加入pH 2的鹽酸250 mL,70 ℃加熱2 h,并抽濾取濾液。濾渣再加入200 mL鹽酸溶液,70 ℃加熱提取2 h,抽濾取濾液。合并2 次濾液,用3 500 Da透析袋透析24 h,并將樣品溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),加入95%乙醇溶液沉淀果膠,抽濾,凍干得到白蘿卜果膠。

1.3.1.2 白蘿卜果膠的改性

參考Zaidel等[20]的方法,略有改動(dòng)。將凍干的白蘿卜果膠溶解到pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中,然后加入0.5 mmol/L的阿魏酸1 mL和0.5 mL過氧化物酶(15 U/mL含少量H2O2),對照組加入等量的蒸餾水。將2 組樣品放入45 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min,將處理好的樣品冷凍干燥,并放入-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 果膠色度的測定

將改性和未改性的果膠配制成1%的果膠溶液,分別用UitraScan XE型色度儀測定其顏色差異。通過L*、a*、b*值可以表征改性果膠和未改性果膠之間的顏色差異。L*代表白度,其值越大,表明樣品顏色越白;a*值代表紅綠,若a*值為正值且越大,表明樣品顏色越紅,若a*值為負(fù)值且越小,表明樣品顏色越綠;b*值代表黃藍(lán),值越大則顏色越偏向黃色,反之b*值越小則越偏向藍(lán)色。

1.3.3 流變學(xué)的測定

1.3.3.1 茹度的測定

參考Karaki等[26]的方法,略有改動(dòng)。將改性和未改性的果膠分別用pH 6.5的緩沖液配制成6%的果膠溶液(預(yù)實(shí)驗(yàn)確定),用直徑為60 mm的平板,25 ℃條件下進(jìn)行測量,剪切速率從0.001～100 s-1變化。

1.3.3.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué)測定

動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性用儲(chǔ)能模量G’和損耗模量G”表征,用直徑為60 mm的平板,在25 ℃條件下進(jìn)行測量,應(yīng)變掃描頻率0.1～100 Hz,壓力0.1 Pa。

1.3.4 抗氧化性的測定

參考王杰等[27]的方法。提取液制備:分別取改性果膠、未改性果膠和VC各375 mg,定容至50 mL,分別取其中1、2、3、4、5 mL用蒸餾水定容至25 mL,即得質(zhì)量濃度分別為0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mg/mL的溶液。

DPPH試劑配制:精確稱取0.026 2 g的DPPH,用無水甲醇進(jìn)行溶解并定容至50 mL,搖勻,作為儲(chǔ)備液保存于冰箱中,測定時(shí)用無水甲醇將其稀釋10 倍。

抗氧化活性測定:準(zhǔn)確移取4 mL樣品于試管中,加入4 mL的DPPH溶液,充分搖勻,暗置30 min,在波長517 nm處測定其吸光度A1;同時(shí)測定樣品待測液4 mL與50%甲醇溶液4 mL混合液在波長517 nm處吸光度A2;DPPH溶液4 mL與50%甲醇溶液4 mL在波長517 nm處測定吸光度A3(空白)。每種樣品測3 個(gè)平行,取平均值,DPPH自由基清除率按下式計(jì)算:

1.3.5 紫外波長全掃描

將改性果膠和未改性果膠分別配制成質(zhì)量濃度為0.005 g/mL的果膠溶液,用紫外分光光度計(jì)在200～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描,測定改性和未改性果膠最大吸收波長。

1.3.6 掃描電鏡

分別取干燥后的阿魏酸樣品、果膠樣品,阿魏酸和果膠直接混合樣品和阿魏酸改性的果膠樣品,用掃描電鏡觀察表面結(jié)構(gòu)特性。將4 種樣品分別固定、噴金后,用SU-8018型掃描電鏡各放大100 倍和250 倍進(jìn)行觀察。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜掃描

分別取果膠提取樣品和改性果膠樣品1～2 mg與100 mg KBr混合研磨壓片,進(jìn)行紅外光譜掃描。在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描收集譜峰,掃描次數(shù)為32 次,光譜分辨率為4 cm-1,每個(gè)樣品重復(fù)掃描16 次,并扣除KBr背景光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,所得數(shù)據(jù)用Data Processing System(DPS 15.10)軟件進(jìn)行差異顯著性分析,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸處理對蘿卜果膠色度的影響

圖1 不同處理果膠色度圖Fig. 1 Photographic images of native and modified pectin

圖2 不同處理果膠的L*、a*、b*值Fig. 2 L*, a* and b* values of native and modified pectin

由圖1、2可以看出,未改性果膠的L*值顯著大于改性果膠(P＜0.05),說明未改性的果膠顏色更白;改性果膠的a*值為負(fù)值,顯著小于未改性的果膠,表明改性后果膠偏向綠色;改性果膠的b*值顯著大于未改性果膠(P＜0.05),說明改性后的果膠顏色偏黃。綜上所述,改性后的果膠白度下降,顏色呈現(xiàn)黃色,這與肉眼觀察到的結(jié)果一致。導(dǎo)致改性果膠顏色變黃的原因可能是阿魏酸在酶的催化作用下發(fā)生氧化交聯(lián)反應(yīng),改變了果膠原來的顏色。

2.2 阿魏酸處理對果膠抗氧化性的影響

圖3 不同處理果膠的DPPH自由基清除率Fig. 3 DPPH radical scavenging effect of VC and native and modified pectin

由圖3可知,VC的抗氧化性高達(dá)95%左右;未改性果膠的DPPH自由基清除率只有10%,說明未改性的果膠抗氧化性很低;而改性的果膠抗氧化性隨著果膠質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng),在質(zhì)量濃度大于0.6 mg/mL后趨于平緩,雖然VC和未改性果膠的質(zhì)量濃度選取不是最佳,但仍可以說明阿魏酸改性顯著增強(qiáng)了果膠的抗氧化能力。這可能是由于經(jīng)阿魏酸改性果膠的羧基更加活潑更容易解離出氫離子與DPPH自由基結(jié)合還原成DPPH—H,導(dǎo)致改性果膠清除DPPH自由基的能力更強(qiáng)[28-29],具體原因還需進(jìn)一步分析。

2.3 阿魏酸處理對果膠流變學(xué)性質(zhì)的影響

圖4 改性果膠和未改性果膠黏度（A）和頻率（B）掃描圖Fig. 4 Viscosity versus frequency curves of native and modified pectin

如圖4A所示,改性果膠和未改性果膠的茹度都隨著剪切速率的增大而減小,均為假塑性流體。此外,改性后的果膠茹度大于未改性的果膠。阿魏酸改性顯著增加了果膠茹度,這可能與阿魏酸與果膠發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[30]。

由圖4B可知,改性果膠和未改性果膠G”增長趨勢相似;但改性果膠G’的增長趨勢要高于未改性果膠,表明果膠用阿魏酸改性后更趨向于固體性質(zhì)。

2.4 阿魏酸處理對蘿卜果膠紫外吸光度的影響

圖5 改性果膠和未改性果膠的紫外-可見吸光度Fig. 5 UV-visible absorption spectra of native and modi fied pectin

如圖5所示,2 種果膠在波長200 nm處都有強(qiáng)吸收峰,這是水溶液的溶劑峰,除此之外,未改性的果膠沒有其他吸收峰;但改性果膠在260～280 nm有吸收峰,芳香族化合物在此波長處會(huì)有吸收峰。改性的果膠在300～320 nm也有吸收峰,因?yàn)榘⑽核嵩?20 nm波長處有特征吸收峰,這說明改性果膠中己經(jīng)含有一定量的阿魏酸,有研究指出阿魏酸可以通過酯鍵與果膠多糖共價(jià)連接[31],此結(jié)果證實(shí)了果膠與阿魏酸可能發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)。

2.5 阿魏酸處理果膠對其表面微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖6 阿魏酸、果膠、阿魏酸和果膠混合物、改性果膠的掃描電鏡圖Fig. 6 SEM micrographs of ferulic acid, pectin, their physical mixture and modified pectin

如圖6所示,阿魏酸其結(jié)構(gòu)形狀呈針狀晶體;果膠呈現(xiàn)蓬松的塊狀結(jié)構(gòu);阿魏酸和果膠的直接混合物可以明顯看出,針狀結(jié)構(gòu)的阿魏酸和塊狀疏松的果膠散落分布;阿魏酸改性的果膠可以看出,果膠與阿魏酸發(fā)生結(jié)合,改變了原有的蓬松塊狀的表面結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)出與物理混合完全不同的結(jié)構(gòu),這表明阿魏酸改性果膠己使其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.6 阿魏酸處理果膠對其傅里葉變換紅外光譜的影響

圖7 阿魏酸（a）、果膠（b）、阿魏酸和果膠混合（c）、改性果膠（d）的傅里葉變換紅外光譜Fig. 7 FT-IR spectra of ferulic acid (a), pectin (b), their physical mixture (c) and modified pectin (d)

如圖7所示,阿魏酸的紅外光譜具有明顯的羥基吸收峰(3 436 cm-1)、芳香族共軛羰基(1 692 cm-1)和芳香環(huán)吸收帶(1 620、1 517 cm-1),這都是酚類物質(zhì)的特征吸收峰。果膠的紅外光譜,其在3 410 cm-1處有較寬的—OH伸縮振動(dòng)吸收峰,并且在1 090 cm-1處有—OH的形變振動(dòng)吸收峰。阿魏酸和果膠直接混合物的紅外光譜,與阿魏酸的紅外光譜相似,可能是阿魏酸相對于果膠比例過多造成的。阿魏酸改性的果膠,其紅外光譜與阿魏酸和果膠直接混合的紅外譜圖相比,改性的果膠在3 400 cm-1處峰變寬加深,且2 920 cm-1處甲基—CH的振動(dòng)峰增強(qiáng)。此外,物理混合于改性果膠相比,1 620、1 517、1 113 cm-1處的譜帶發(fā)生移動(dòng),這個(gè)結(jié)果與Wang Jing等[32]的結(jié)果一致,推測可能是由于阿魏酸的多酚羥基和果膠的羥基之間形成氫鍵造成的。

3 結(jié) 論

用阿魏酸和辣根過氧化物酶對白蘿卜果膠進(jìn)行改性,使果膠的顏色、流變學(xué)性質(zhì)、表面微觀結(jié)構(gòu)、基團(tuán)性質(zhì)等方面發(fā)生改變。改性后的果膠與原果膠相比顏色變黃,DPPH自由基清除率顯著增強(qiáng),顯著增強(qiáng)了白蘿卜果膠的抗氧化性。果膠的流變學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,改性果膠的茹度增強(qiáng),且G’增大,樣品更偏向于固體性質(zhì)。白蘿卜果膠在阿魏酸和過氧化物酶的作用下表面的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,阿魏酸使原本分散的果膠分子緊密連接在一起。此外,果膠的最大吸光度和基團(tuán)特征吸收峰的峰值發(fā)生變化,說明阿魏酸處理果膠形成了新的物質(zhì)。阿魏酸和辣根過氧化物酶處理能夠改進(jìn)果膠的功能性,這一研究結(jié)果為改善果膠的功能性質(zhì)提供了新的方法,為推廣到其他多糖的改性生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。