2018年江蘇省人感染布魯氏菌分離株分子特征分析

談忠鳴，汪秀斌，周偉忠，董 晨，周 璐，洪 捷，錢慧敏，胡建利，鮑倡俊

布魯氏菌病(簡稱布病)是一種由布魯桿菌引起的人獸共患的傳染病，人主要通過接觸患病的牲畜或污染物感染發(fā)病。我國以羊種布魯氏菌感染為主，國外以牛種布魯氏菌為主[1]。布病可以表現(xiàn)為局部膿腫，可引起患者全身多系統(tǒng)的損害，對骨關(guān)節(jié)的損害較多?；颊咧饕憩F(xiàn)為發(fā)熱(多為弛張熱)、多汗、全身乏力、關(guān)節(jié)痛和肌肉疼痛，病情嚴(yán)重時可喪失勞動能力，如不及時治療，易轉(zhuǎn)為慢性，增加治愈難度。目前發(fā)現(xiàn)的布魯氏菌已有10個種(Brucellamelitensis，Brucellaabortus，Brucellasuis，Brucellaovis，Brucellaneotomae，Brucellacanis，Brucellamicroti，Brucellaceti，Brucellapinnipedialis，Brucellainopinata)[2]，感染人的布魯氏菌主要以羊種(B.melitensis)、牛種(B.abortus)及豬種(B.suis)為主[3]。

布病在全國所有省份都有病例報告，主要集中在新疆、河北、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、遼寧等北方地區(qū)。布病患者往往是因為接觸患病動物感染，所以由于其所從事的工作而感染情況較多，比如養(yǎng)殖廠工人、獸醫(yī)、屠宰加工人員、奶制品和皮毛加工人員等(簡稱布病職業(yè)人員)。江蘇省為布病非流行區(qū)[3]，2005年報道首例病例后，2005-2011年布病累計報告病例數(shù)開始緩慢上升，2012年后布病疫情明顯呈上升趨勢。至2014年疫情已擴(kuò)散至全省所有省轄市并呈現(xiàn)逐年高發(fā)趨勢。

AMOS-PCR可以鑒別鑒別牛種、羊種及豬種布魯氏菌的多重PCR方法[4]。多位點(diǎn)序列分析(Multilocus sequence analysis, MLSA)是一種基于以核苷酸序列為基礎(chǔ)，通過對9個管家基因進(jìn)行測序，比較不同樣本的等位基因多樣性。它是高通量測序技術(shù)與成熟的群體遺傳學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，簡單易行，重復(fù)性好，可以通過國際互聯(lián)網(wǎng)對某一病菌株在全球范圍內(nèi)的傳播情況進(jìn)行追蹤監(jiān)測[5]。多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA)是利用細(xì)菌基因組中不同等位基因中串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)多少來進(jìn)行基因分型的技術(shù)。MLVA具有較高的靈敏度和特異性，并且具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可在全球范圍內(nèi)進(jìn)行實驗室數(shù)據(jù)交流與共享，用于基因分型研究及突發(fā)事件中病因的溯源，兩種方法在全球的布魯氏菌病的流行病學(xué)研究調(diào)查中起到重要的作用[6]。

為進(jìn)一步預(yù)防控制江蘇省布魯氏菌的感染，本研究運(yùn)用AMOS-PCR、MLSA、MLVA 3種分子分型方法對2018年收集的人間布魯氏菌進(jìn)行特征分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 通過哨點(diǎn)醫(yī)院收集2018年全省人感染布魯氏菌菌株。分離純化菌株接種在含5%羊血平板上，注意無菌操作，四區(qū)劃線，放置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。同時對各醫(yī)院上報的布魯氏菌病患者進(jìn)行流行病學(xué)資料收集。

1.2試劑與儀器 Rapid Taq Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)，PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，QIAamp DNA mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)，TaKaRa Mini Best Agarose Gel DNA Extraction Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)。梯度PCR儀(Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)、毛細(xì)管電泳儀(Qiagen, Hilden, Germany)，Applied Biosystems/HITACHI 3500xL一代測序儀(Hitachi High-technologies Corporation, Tokyo, Japan)。

1.3核酸的提取 用接種環(huán)刮取細(xì)菌加入含200 μL無菌生理鹽水的E-P管中。采用QIAamp DNA mini kit試劑盒提取DNA，具體操作步驟參照試劑盒使用說明書進(jìn)行，核酸-80 ℃保存待用。

1.4AMOS-PCR 根據(jù)插入序列IS711分別在牛、羊、豬3個種型的基因組中插入位置的差異，可以根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小來鑒別3種布魯氏菌[4]。反應(yīng)體系為：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL，DNA模板2 μL，H2O補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析后，直接記錄PCR產(chǎn)物大小。

1.5MLSA 多位點(diǎn)序列分析方法通過對布魯氏菌管家基因進(jìn)行測序分析，研究該菌的遺傳和進(jìn)化[5]。對布魯氏菌9個管家基因(gap，aroA，glk，dnaK，gyrB，trpE，cobQ，omp25及int-hyp)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸5 min。MLSA產(chǎn)物用TaKaRa試劑盒回收后上機(jī)測序。

1.6MLVA 根據(jù)文獻(xiàn)報道[6]，對布魯氏菌的3組(panel 1、panel 2A、panel 2B)16個等位基因(panel 1：Bruce06，Bruce08,Bruce11,Bruce12，Bruce42，Bruce43，Bruce45 and Bruce55；panel 2A：Bruce18，Bruce19 and Bruce21；panel 2B：Bruce04，Bruce07，Bruce09，Bruce16 and Bruce30)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析后，記錄PCR產(chǎn)物大小。

1.7數(shù)據(jù)分析 測序結(jié)果用Lasergene軟件包和MEGA 4.1軟件進(jìn)行編輯[7]。確定9個等位基因序號構(gòu)成的基因型(Sequence Type，ST), 并用eBURST軟件與數(shù)據(jù)庫內(nèi)國際參考株的ST型進(jìn)行聚類分析。MLVA序列分析出每株菌16個等位基因的串聯(lián)數(shù)后，將串聯(lián)數(shù)做為字符型數(shù)據(jù)導(dǎo)入BioNumerics 5.1(Applied Maths, Belgium)軟件，利用非加權(quán)配伍組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1地區(qū)分布 通過大疫情網(wǎng)收集全省布病病例數(shù)據(jù)，通過致病菌識別網(wǎng)收集布魯氏菌株。2018年江蘇省報告病例數(shù)共175例(省內(nèi)病人141例，省外病人在我省就醫(yī)的有34例)。江蘇省病例最多的5個市分別為徐州(49例)、連云港(21例)、南通(18)、南京(13例)和蘇州(11例)；全年收集菌株56株，分離最多的5個市為連云港(16株)、南通(16株)、徐州(5株)、蘇州(4株)和鹽城(4株)。

2.2AMOS-PCR 所有菌株培養(yǎng)提取核酸后進(jìn)行核酸檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析后顯示，除1株菌(JS-2018-61)結(jié)果為陰性，其余均為羊種布魯氏菌(310 bp)，見圖1。

圖1 羊種布魯氏菌毛細(xì)管電泳分析圖Fig.1 Capillary electrophoresis diagram of PCR products from Brucella melitensis

2.3MLSA分型 對所有菌株進(jìn)行MLSA分析，PCR產(chǎn)物測序后與MLSA數(shù)據(jù)庫基因序列比對，確定JS-2018-61為豬種ST17型(1-6-4-1-5-3-5-2-4)，其余均為羊種ST8型(3-2-3-2-1-5-3-8-2)。

ST8型和ST17型的9個等位基因型做為字符型數(shù)據(jù)導(dǎo)入eBURST軟件，并與數(shù)據(jù)庫內(nèi)已有的35種ST型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，運(yùn)算方法為非加權(quán)配伍組平均法(UPGMA)。聚類圖顯示ST17與ST18、ST20、ST21型聚在同一簇中，ST8型與ST7、ST9、ST10、ST11、ST12、ST34及ST35型聚在同一簇中，見圖2。

圖2 布魯氏菌全部35個ST型聚類eBURST圖Fig.2 The eBURST diagram of population snapshot by Brucella spp. 35 sequence types

2.4MLVA分析 本研究對分離到的布魯氏菌株的16個MLVA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳分析PCR產(chǎn)物大小(圖3)。確認(rèn)所有等位基因的串聯(lián)數(shù)后，做為字符型數(shù)據(jù)BioNumerics 5.1軟件UPGMA算法進(jìn)行聚類分析，見圖4。

MLVA將江蘇省2018年收集的56株布魯氏菌分離株分為47個基因亞型(46個羊種型，1個豬種型)。豬種布魯氏菌與羊種布魯氏菌存在較大差異(基因型相似度只有30%)，羊種布魯氏菌主要分為2個分支，其中一簇JS-2018-19、JS-2018-10、 JS-2018-21、JS-2018-63主要分布于連云港和徐州。另簇分離株分布于其他地區(qū)，兩分支基因型相似度為70%(14/16)。 江蘇分離株JS-2018-22、JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38為同一基因型。JS-2018-14和JS-2018-18，JS-2018-7和JS-2018-31，JS-2018-28和JS-2018-47，JS-2018-13和 JS-2018-44，JS-2018-10和JS-2018-30，JS-2018-42和 JS-2018-43分別為同一基因型，其他均為獨(dú)立的基因型。

圖3 布魯氏菌MLVA-16 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分析圖

圖4 2018年江蘇省布魯氏菌MLVA聚類圖Fig.4 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping relationships of Brucella spp. isolates from Jiangsu Province in 2018

3 討 論

近幾年，隨著貿(mào)易的發(fā)展，布病流行越來越嚴(yán)重。江蘇省2005年開始陸續(xù)報道感染布病病例，2005-2011年布病累計報告病例數(shù)僅55例[8-10]，2012年以后江蘇省布病疫情明顯呈上升趨勢，至2014年疫情已擴(kuò)散至全省所有省轄市并呈現(xiàn)逐年高發(fā)趨勢，2017年江蘇省共報告布病195例，全省報告發(fā)病率0.24/10萬，較2016年發(fā)病率上升36.97%，無死亡病例報告。

江蘇省2018年布病的流行病學(xué)特征顯示全年均可發(fā)布發(fā)病，夏季高發(fā)，冬季發(fā)病較少，夏季高發(fā)的原因可能與徐州地區(qū)的伏羊節(jié)有關(guān)。2018年全省年發(fā)病率前3的地區(qū)分別為徐州、連云港和南通，均為江蘇中北部地區(qū)。布病患者往往是因為接觸患病動物感染，因此從事相關(guān)工作的職業(yè)人群感染情況較多。江蘇省病例以男性為主，且30～70歲的農(nóng)民居多[9-10]，可能與該省飼養(yǎng)牲畜主要以散養(yǎng)方式為主，多為男性在從事相關(guān)活動，養(yǎng)殖方式缺乏專業(yè)知識和規(guī)范化的管理，無防護(hù)意識增加了感染布病的風(fēng)險。

根據(jù)插入序列IS711分別在牛、羊、豬3個種型的基因組中根據(jù)插入位置的差異設(shè)計的AMOS-PCR方法[11]，可同時鑒別感染人的3種布魯氏菌，并在敏感性和特異性上均高于傳統(tǒng)方法。但本研究結(jié)果顯示，豬種布魯氏菌檢測結(jié)果為陰性，說明該方法無法鑒定所有生物型的豬種布魯氏菌，存在一定的局限性。

MLSA研究發(fā)現(xiàn)江蘇省布魯氏菌病以羊種ST8型為主，與歷年相同[12-13]，但今年首次發(fā)現(xiàn)我省人感染豬種布魯氏菌ST17型，該型也是我國目前豬種布魯氏菌的主要流行ST型[14]，說明江蘇省出現(xiàn)其他種型布魯氏菌輸入的現(xiàn)象。

MLVA發(fā)現(xiàn)羊種布魯氏菌全部為“東地中海簇”，與國內(nèi)報道相同[15]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)所有病例均為散發(fā)病例，但根據(jù)MLVA結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)部分分離株具有相同基因型，其中JS-2018-22、JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38為同一基因型，其中JS-2018-22發(fā)現(xiàn)于泰州，JS-2018-24、JS-2018-35、JS-2018-38分離自南通，這兩個地區(qū)相鄰，JS-2018-22為待業(yè)人員，JS-2018-24和JS-2018-35 為農(nóng)民，JS-2018-38在山羊市場工作，這4人存在潛在聯(lián)系。

本研究揭示了江蘇省2018年人間布魯氏菌的主要流行株的種型和基因型，為將來疫苗株的篩選生產(chǎn)提供了主要方向[16]，并通過MLSA和MLVA 2種分子分型技術(shù)確認(rèn)了江蘇省首例人感染豬種布魯氏菌。同時也暴露出隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，與之相配的制度體系不夠完善，使疫情防控更加困難，應(yīng)加強(qiáng)牲畜檢驗檢疫及執(zhí)行力度，優(yōu)化免疫補(bǔ)助機(jī)制，完善撲殺補(bǔ)助政策。

利益沖突：無