仔豬肺、腸組織離體感染模型的建立及應(yīng)用

黃石磊，謝錄異，余秋寒，冉 玲，楊 洋，王 凱，宋振輝*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶 404000；3.重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院， 重慶 404100)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diahorrea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和豬呼吸道冠狀病毒(porcine respiratory coronavirus，PRCoV)同屬于冠狀病毒科，其中PEDV、TGEV常引起豬的急性腸道傳染病，臨床癥狀以嘔吐、腹瀉、食欲下降、脫水為主，感染20日齡以?xún)?nèi)的哺乳仔豬死亡率高達(dá)95%以上[1]；PRCoV主要侵害2～3 周齡階段正處于哺乳期的仔豬，感染率極高，但發(fā)病率和病死率低，感染期間表現(xiàn)輕微的呼吸道炎癥，間發(fā)性咳嗽和氣喘[2]。單純的呼吸道冠狀病毒感染只表現(xiàn)短期咳嗽，并無(wú)其他表現(xiàn)。許多研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)各地發(fā)生和流行的豬病毒腹瀉疾病多是PEDV、TGEV 、PRCoV等混合感染引起豬死亡[3]。目前在這些病原方面的研究多局限細(xì)胞水平上，缺少一個(gè)能模擬在體內(nèi)狀態(tài)的模型，因此建立病原離體感染的模型，對(duì)于研究病原感染的機(jī)制具有重要意義。

精密組織切片(precision-cut tissue slices，PCTS)做為一種離體模型于1923年首次發(fā)明，用于測(cè)量腫瘤組織中細(xì)胞代謝和耗氧量，以及研究包括人類(lèi)在內(nèi)的各種器官和物種的氨基酸代謝[4]。目前國(guó)內(nèi)少有對(duì)精密切割組織切片的研究，僅有的研究也局限于精密肝切片上的代謝、藥理、毒理和轉(zhuǎn)運(yùn)等方面。如，李婧婷等[5]利用精密肝切片(PCLS)技術(shù)，創(chuàng)建醋氨酚所致肝切片損傷的體外模型，并探討CYP2E1活性變化對(duì)肝損傷的調(diào)節(jié)作用；郭喻等[6]用于體外肝臟異物代謝和藥物相互作用研究；國(guó)外則早已運(yùn)用此技術(shù)，但熱點(diǎn)多集中于代謝、藥理、毒理、轉(zhuǎn)運(yùn)，藥物評(píng)估和免疫反應(yīng)等方面的研究，少數(shù)集中于對(duì)病原感染的機(jī)制研究，如DARSANIYA等[7]使用精密腸切片作為培養(yǎng)系統(tǒng)，分析禽流感病毒在分化腸上皮細(xì)胞的感染；DELGADO等[8]利用精密切割肺片作為離體模型研究了新生豬氣管細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞和精密切割肺片對(duì)H3N2亞型豬流感病毒的先天免疫反應(yīng)。然而，國(guó)內(nèi)則未曾將其應(yīng)用于動(dòng)物感染模型的研究。

本研究首先建立仔豬肺、腸離體感染模型，通過(guò)對(duì)TGEV、PEDV和PRCoV 3種病毒的感染試驗(yàn)的初探，可為病毒機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，也能為病毒疾病的防控提供理論依據(jù)，減少給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料Williams培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺、1×RPMI1640、DMEM basic (1×)均購(gòu)自美國(guó) GIBCO生物技術(shù)公司；RPMI.1640培養(yǎng)液(2×)購(gòu)自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；硫酸慶大霉素、兩性霉素B購(gòu)自北京Solarbio生物技術(shù)公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；OCT冷凍包埋劑購(gòu)自日本櫻花公司；StayBriteTMHighly Stable ATP Bioluminescence Assay Kit購(gòu)自美國(guó)BioVision公司；HEPES購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；FETAL BOVINE SERUM購(gòu)自中國(guó)CLARK Bioscience公司；Avicel RC 591購(gòu)自上海富曼實(shí)食品科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。PEDV CV777、TGEV GFP、PRCoV均為實(shí)驗(yàn)室保存毒株。

1.2 仔豬小腸及肺精密切片感染模型的制作

1.2.1腸精密切片 安樂(lè)死仔豬后迅速剖解，小心去除粘附的脂肪組織并剪取十二指腸(大約在胃遠(yuǎn)端前10 cm)，回腸(回盲連接處近端約10 cm)，空腸(十二指腸和回腸之間)腸管。然后將這些小腸切成幾段，用塑料移液管通過(guò)管腔吸取冰冷的KHB進(jìn)行輕輕沖洗小腸直至干凈，將其轉(zhuǎn)移到冰冷的KHB中；將腸斷的一頭用夾子夾住，吸取37℃的3%的低熔點(diǎn)瓊脂糖從未夾住一頭注入腸腔內(nèi)，使小腸充盈起來(lái)，兩頭結(jié)扎后置于冰冷的KHB溶液中等待5～10 min至瓊脂糖凝固，隨后對(duì)腸斷包埋固定后置于切片機(jī)切片，厚度為150～450 μm最為適宜，切出腸片后迅速轉(zhuǎn)移至37℃含有WME的24孔板中，每孔1～2片在預(yù)孵育1～3 h后更換新的培養(yǎng)基以恢復(fù)ATP含量并去除細(xì)胞碎片；每24 h更換1次新的培養(yǎng)基。

1.2.2肺精密切片 安樂(lè)死仔豬后將肺葉迅速取出，找到肺葉的氣管口，用不銹鋼的平口長(zhǎng)針輕緩的順著主氣管的方向插入，注意插入過(guò)程一定要小心平緩，防止平口針頭戳穿氣管。然后用50 mL的注射器吸取預(yù)先預(yù)熱在37℃培養(yǎng)箱中的1.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，連接平口針頭，緩緩向肺內(nèi)注入1.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，邊注入邊把平口針頭緩緩向外移動(dòng)，直到整個(gè)肺葉充盈起來(lái)，注意不要過(guò)分充盈，防止肺葉充盈過(guò)度而破裂；夾住氣管口包埋與冰盒中，帶瓊脂糖充分凝固，隨后修剪肺葉，找到單個(gè)支氣管處進(jìn)行切割，后續(xù)操作參照腸精密切片。

1.3 腸精密切片活力測(cè)定(ATP)的測(cè)定各取0，3，12，24，48，72 h的腸切片3片放入1.5 mL的EP管中，存于-80℃；取出切片,每管加入100 μL Reaction Buffer.將收集的腸切片置于1.5 mL EP管內(nèi)，使用 TGrinder第3代變速組織碾磨器碾磨器間歇操作破碎腸切片樣本，然后繼續(xù)在冰上裂解5 min 后，12 000 r/min 離心3 min 后取上清；根據(jù)說(shuō)明書(shū)，在避光，無(wú)菌條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品和試驗(yàn)樣品，最后使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定read luminescence (L)，然后計(jì)算樣品ATP含量，繪制曲線(xiàn)圖。

1.4 肺精密切片活力測(cè)定EBSEN等[9]對(duì)纖毛上皮的搏動(dòng)進(jìn)行了定期監(jiān)測(cè)。發(fā)現(xiàn)纖毛上皮的搏動(dòng)是一個(gè)可靠的評(píng)價(jià)PCLS活性的可行性指標(biāo)。因此，我們?cè)谇衅谱魍瓿? h后更換新的培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察纖毛搏動(dòng)為100%的肺切片，并做好標(biāo)記，之后每隔24 h于鏡下觀察做好標(biāo)記的肺切片的纖毛搏動(dòng)情況，并記錄纖毛搏動(dòng)情況，繪制肺切片活性圖。

1.5 病毒感染經(jīng)活性檢測(cè)合格后，腸切片感染PEDV CV777、TGEV GFP，肺切片感染PRCoV。棄去WME維持液，PBS洗2次， 將TGEV GFP病毒液用WME按照1∶2稀釋好后，每孔接種200 μL；PEDV CV777病毒液用WME(含25 μg/L的胰酶)按照1∶3稀釋?zhuān)靠捉臃N200 μL；輕輕晃動(dòng)使其病毒液均勻，接種于腸切片上，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)1 h，病毒孵育期間，每隔15 min 晃動(dòng)1次24孔板；1 h后，棄去病毒液，更換WME維持液(含有工作濃度為1 mg/L克霉唑，10 mg/L 恩諾沙星，2.5 mg/L兩性霉素B，50 mg/L硫酸慶大霉素和1%的青鏈霉素)，其中PEDV CV777感染組更換的WME維持液還含有25 μg/L的胰酶，每孔1 mL，采集培養(yǎng)液上清1 mL，并記為0 h的切片上清液樣品，之后分別按2，6，24，48 h采取的切片培養(yǎng)上清液，做好標(biāo)記密封存于-80℃。

PRCoV液與RPMI 1640按照1∶1稀釋后置于冰上暫存；選取纖毛搏動(dòng)為100%單個(gè)氣管的肺切片，棄去舊的培養(yǎng)液，無(wú)菌的PBS洗3次，每孔加入200 μL預(yù)先稀釋好的PRCoV液，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間每隔15 min晃動(dòng)1次；1 h后，更換新的RPMI 1640,每孔1 mL，繼續(xù)放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 上清液中病毒PCR檢測(cè)將采集病毒液反復(fù)凍融3次后按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增反應(yīng)按13 μL 體系進(jìn)行：7.375 μL RNase Free H2O，2.5 μL 5×PCR Buffer，0.5 μL TaKaRa ExHs，上下游引物各0.125 μL，2 μL RT 產(chǎn)物。充分震蕩混勻，瞬時(shí)離心，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃褪火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

表1 PCR引物序列

1.7 免疫熒光方法檢測(cè)病毒是否成功感染切片切片在感染病毒的0，6，24，48 h采集切片組織并用冷凍包埋劑包埋后進(jìn)行液氮冷凍，待完全冰凍后取出，平衡至室溫后按免疫熒光染色方法對(duì)切片進(jìn)行熒光染色，最后通過(guò)激光共聚焦觀察病毒感染情況。

2 結(jié)果

2.1 仔豬小腸精密切片的制作7日齡仔豬小腸的腸腔直徑大小存在特殊性，為保證仔豬小腸結(jié)構(gòu)的完整性，因此將洗凈的小腸填充3%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，修飾成需要的組織塊之后，包埋在與切片機(jī)大小匹配的包埋盒之后再進(jìn)行切片(圖1)，能得到具有相同的厚度，顏色均勻和邊緣光滑的小腸切片，在普通倒置顯微鏡下呈現(xiàn)完整的結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 仔豬小腸精密切片絨毛微結(jié)構(gòu)圖 (×10)

圖1 仔豬小腸精密切片制作圖

2.2 仔豬肺精密切片的制作結(jié)果圖將斷奶仔豬處死后，用止血鉗夾住總支氣管立即取出整個(gè)肺臟后，在氣管里注入37℃的1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖之后，置于冰盒凝固，凝固之后取出肺組織進(jìn)行修飾，然后置于切片機(jī)進(jìn)行切片，將切好的肺切片置于預(yù)先加入培養(yǎng)基的24孔板中(圖3)，最終得到了大小一致，厚度均勻，大多為單個(gè)支氣管的仔豬肺精密切片，普通倒置顯微鏡下能看到完整的支氣管纖毛，肺纖毛搏動(dòng)劇烈(圖4)。

圖4 仔豬肺精密切片支氣管結(jié)構(gòu)圖(×20)

圖3 仔豬肺精密切片制作過(guò)程 A.取出肺臟用止血鉗夾住肺葉；B.手術(shù)刀切除止血鉗夾住的肺葉后放入冰冷的無(wú)菌PBS中；C.1.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖注入到肺組織中；D.將低熔點(diǎn)瓊脂糖填充的肺臟置于冰盒中凝固；E.從冰盒中取出肺臟，松開(kāi)止血鉗；F.切除肺臟邊緣狹窄部分；G.找到大小適宜的單個(gè)支氣管，用組織取芯刀切割；H.修飾好的肺組織塊置于切片機(jī)上切片；I.挑選切好的肺切片置于裝有培養(yǎng)液的24孔板中

2.3 仔豬腸精密切片的活性測(cè)定首先根據(jù)ATP檢測(cè)試劑盒得出ATP檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，隨后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出小腸切片當(dāng)中ATP的確切含量，結(jié)果如圖5所示，在仔豬小腸精密切片剛制作完成時(shí)，ATP含量最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，仔豬小腸精密切片ATP含量在逐漸下降，在12 h時(shí)，ATP含量降低的最快，48 h后，仔豬小腸精密切片含量逐漸下降至零。由于ATP作為最重要的能量分子，在細(xì)胞凋亡時(shí)ATP水平也下降，所以根據(jù)ATP含量，推測(cè)出小腸切片的活性在0 h時(shí)最大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小腸切片的活性也隨之降低，在48 h后逐漸喪失活性。

圖5 仔豬小腸精密切片ATP含量

2.4 仔豬肺精密切片的活性測(cè)定將切割好的仔豬肺精密切片置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察肺纖毛搏動(dòng)情況，繪制肺精密切片的活性圖(圖6)，可知，仔豬肺精密切片的在96 h內(nèi)的纖毛活性都為100%，之后逐漸下降到50%左右。表明仔豬肺精密切片具有很好的活性。

圖6 仔豬肺精密切片的活性

2.5 切片病毒感染后上清液的PCR檢測(cè)為驗(yàn)證病毒已成功感染切片，我們分別在感染病毒后的2，6，24，48 h檢測(cè)上清液中病毒存活情況，結(jié)果如圖7所示，PEDV CV777在750～500 bp之間有1條帶，TGEV GFP則在750～1 000 bp之間有1條帶，PRCoV則在1 300 bp有1條帶，均與陽(yáng)性對(duì)照組一致，說(shuō)明精密切片在感染病毒后這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)間，均能在切片上成功復(fù)制，并將病毒粒子釋放到培養(yǎng)上清液中。

圖7 上清液病毒PCR檢測(cè) A.仔豬小腸切片上清液PEDV m基因的檢測(cè);B.仔豬小腸切片上清液TGEV m基因的檢測(cè);C.仔豬肺精密切片上清液PRCoV S基因的檢測(cè);M.DL2000 Marker; 1～4.0,24,48,72 h; 5.陰性對(duì)照; 6.陽(yáng)性對(duì)照

2.6 免疫熒光檢測(cè)切片感染后病毒在絨毛上的定殖水平

2.6.1PEDV CV777、TGEV GFP在腸絨毛上的定殖水平 為了進(jìn)一步驗(yàn)證仔豬小腸精密切片能夠作為離體感染模型，將PEDV CV777和TGEV GFP感染感染精密腸切片后，采集陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組仔豬小腸精密切片，進(jìn)行免疫熒光染色，其中紅色熒光為PEDV N蛋白，綠色熒光為T(mén)GEV GFP病毒,藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。結(jié)果顯示(圖8)，在感染后的0，24，48 h都存在紅色熒光，說(shuō)明PEDV CV777成功感染仔豬小腸精密切片，但由于PEDV的感染需要胰蛋白酶，因此隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)小腸切片部分腸段細(xì)胞溶解;TGEV GFP感染仔豬小腸精密切片結(jié)果顯示(圖9),在感染后的0，24，48 h 都存在綠色熒光，說(shuō)明TGEV成功感染上了仔豬小腸精密切片。

圖9 免疫熒光檢測(cè)TGEV GFP感染PCIS

圖8 免疫熒光檢測(cè)PEDV CV 777感染PCIS

2.6.2PRCoV在肺絨毛上的定殖水平 將PRCoV病毒感染活性為100%的仔豬肺精密切片，采集0，24，48，72 h的肺切片制備冷凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，CY3標(biāo)記的紅色為PRCoV N蛋白，藍(lán)色熒光為DAPI染的細(xì)胞核，由圖10可知，在0，24，48，72 h的肺切片上都存在PRCoV，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，PRCoV的復(fù)制增多，表明仔豬肺精密切片作為離體感染模型能成功感染PRCoV。

圖10 免疫熒光檢測(cè)PRCoV感染PCLS

3 討論

早在20世紀(jì)初，精密組織切片就已經(jīng)被發(fā)明，但其研究領(lǐng)域多用于腫瘤以及物質(zhì)代謝方面的研究，并且切片的活力較差。直到1980年，KRUMDIECK等[10]對(duì)切片制作進(jìn)行了改進(jìn)，大大延長(zhǎng)了組織切片的活力，隨后被廣泛應(yīng)用于藥理，物質(zhì)代謝，毒理學(xué)等方面的研究。對(duì)于精密組織切片的制作，雖然精密切割組織技術(shù)在國(guó)外已經(jīng)是非常成熟，且在半自動(dòng)化的儀器切割使用下，精密組織切片的制作似乎不是什么難點(diǎn)，但是對(duì)不同的切片的制作依然存在很多未被解決的問(wèn)題，尤其是對(duì)于一些非實(shí)質(zhì)性器官，比如腸道等等。

本研究在制作仔豬小腸精密切片時(shí)，維持小腸切片的活力是非常關(guān)鍵的問(wèn)題，由于腸道本身就是容納糞便的容器，存在許多細(xì)菌，腸道的清洗是比較關(guān)鍵的一點(diǎn)，既要防止污染，也要維持小腸切片的活力，因此我們使用冷的KHB緩沖液輕柔的沖洗腸道，防止存在沖洗過(guò)程中腸道沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)維持失去活力以及用力過(guò)猛將小腸絨毛損壞，通過(guò)將腸腔注入3%的37℃低熔點(diǎn)瓊脂糖，并嵌入瓊脂糖中形成固體狀結(jié)構(gòu)，腸道周?chē)沫傊瞧鸬奖Ｗo(hù)PCIS免受修飾等處理過(guò)程和切割程序的影響，并允許可重復(fù)的切割過(guò)程，使其具有一致的PCIS厚度。結(jié)果表明，小腸精密切片的活力基本能維持在48 h，但是活性不如仔豬肺精密切片的活性，而且小腸絨毛會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸脫落，變短。有學(xué)者在培養(yǎng)的過(guò)程中以及在緩沖液充入合適濃度的氧氣，滿(mǎn)足切片的最佳可能培養(yǎng)條件，但是，氣體流入也可能會(huì)導(dǎo)致PCIS的溫度問(wèn)題，如果有條件可以通過(guò)使用自動(dòng)氧合作用的培養(yǎng)箱來(lái)改善豬PCIS的培養(yǎng)條件，或者更換培養(yǎng)液的間隔時(shí)間以及次數(shù)來(lái)滿(mǎn)足切片活力維持的營(yíng)養(yǎng)需要[11]；但也有研究表明，在雞的小腸切片制作與培養(yǎng)中，未充入氧氣，切片的活力依然能較好的維持[7]；

肺是以支氣管反復(fù)分支形成的支氣管樹(shù)為基礎(chǔ)構(gòu)成的，因此完好無(wú)損的取出是決定整個(gè)仔豬肺精密切片的制作成功的關(guān)鍵。肺臟雖然作為實(shí)質(zhì)性器官，但是由于肺臟特殊的生理結(jié)構(gòu)，仍然需要灌入37℃低熔點(diǎn)瓊脂糖，來(lái)充盈肺臟，以便后續(xù)切割出均勻一致的肺精密切片，將瓊脂糖水平從3%調(diào)節(jié)至1.5%，這是產(chǎn)生豬PCLS的最佳濃度。如若在肺臟取出過(guò)程中損傷了，則無(wú)法灌入37℃低熔點(diǎn)瓊脂糖來(lái)充盈肺臟。

為了驗(yàn)證制作的仔豬精密小腸切片和肺精密切片是否能夠作為離體的感染模型，本研究通過(guò)使用TGEV、PEDV感染仔豬小腸精密切片和 PRCoV感染仔豬肺精密切片，使用PCR技術(shù)和免疫熒光方法驗(yàn)證病毒的感染。研究發(fā)現(xiàn)，3種病毒都能成功感染相應(yīng)的切片，但是在利用冰凍切片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)仔豬小腸精密切片不如肺切片保持完好的形態(tài)。研究報(bào)道，TGEV、PEDV病毒的感染仔豬會(huì)導(dǎo)致小腸上皮細(xì)胞脫落[13]；也有研究報(bào)道，胰蛋白酶可以通過(guò)減少細(xì)胞膜的功能性整聯(lián)蛋白的數(shù)量來(lái)破壞細(xì)胞的膜蛋白并降低細(xì)胞與吸附的細(xì)胞粘附蛋白形成粘附鍵的能力，使細(xì)胞膜受到強(qiáng)烈影響，降低細(xì)胞的活性[14]。因此小腸切片的形態(tài)受損可能是由于病毒感染導(dǎo)致小腸絨毛脫落，或者是由于病毒孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)沒(méi)有按期更換培養(yǎng)液以及培養(yǎng)期間未注入合適濃度的氧氣，使仔豬小腸精密切片的活力下降，導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡脫落，此外，在挑取仔豬小腸精密切片進(jìn)行包埋時(shí)，造成了仔豬小腸精密切片的損壞。通過(guò)本試驗(yàn)確定，制作出的精密切片，可作為模擬體內(nèi)感染試驗(yàn)的離體模型，可為相關(guān)疾病的研究帶來(lái)便利和減少試驗(yàn)動(dòng)物的使用。