豬傳染性胃腸炎病毒可視化RT-LAMP檢測(cè)方法的建立

焦韻潔，張 欣，朱海鵬，吳小萍，賈存瑜，趙 毅，周恩民*，穆 楊*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，陜西 楊凌 712100；3. 陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710016)

豬傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的以嘔吐,水樣腹瀉,脫水為特征的一種豬急性腸道傳染病。不同年齡和品種的豬均可感染，常表現(xiàn)為隱性感染或與其他病毒性腹瀉病呈混合感染，暫無(wú)有效的治療藥物，嚴(yán)重制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1-3]。TGE與豬流行性腹瀉(porcine epizootic diarrhea，PED)的臨床癥狀表現(xiàn)非常相似，這給該病的快速診斷以及防治都造成了一定困難。因此，建立有效便捷的TGEV快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)診斷和防治該病均有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是近年普遍應(yīng)用于動(dòng)物疫病病原基因檢測(cè)的快速等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[4-6]。LAMP技術(shù)與其他病原核酸檢測(cè)技術(shù)相比，檢測(cè)僅需普通水浴鍋即可進(jìn)行，并且減少了升溫降溫環(huán)節(jié)，具有高效性和基層適用優(yōu)點(diǎn)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度大小不一的DNA片段[7]，可以采用多種多樣的方式對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，其中直觀目測(cè)法在口岸,臨床動(dòng)物疫病快速檢測(cè)領(lǐng)域越來(lái)越受到青睞。本研究針對(duì)TGEV M基因高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了TGEV的LAMP檢測(cè)方法，并以羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol blue，HNB)為指示劑，使檢測(cè)結(jié)果可以可視化，操作中不需進(jìn)行開(kāi)蓋，進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性，并應(yīng)用建立的方法對(duì)42份臨床仔豬腹瀉小腸及糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，為快速診斷和防控凈化TGE提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞TGEV，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，豬輪狀病毒(PoRV)，豬細(xì)小病毒(PPV)，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，豬圓環(huán)病毒II型(PCV2)以及ST細(xì)胞均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱(chēng)本實(shí)驗(yàn)室)保存；pET-21b-M重組質(zhì)粒菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,鑒定并保存；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑質(zhì)粒提取試劑盒,EasyPure?Viral DNA/RNA Kit試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RNAiso plus,反轉(zhuǎn)錄試劑盒，dNTPs,Taq DNA polymerase,DL2000 DNA Marker均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；DMEM,胰酶,犢牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Invitrogen公司產(chǎn)品；MgSO4和Bst DNA Polymerase購(gòu)自New England Biolabs公司；甜菜堿(Betaine)為Sigma公司產(chǎn)品；羥基萘酚藍(lán)(HNB)購(gòu)自上海麥克林生化科技公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純。

1.3 質(zhì)粒模板制備取本實(shí)驗(yàn)室保存的pET-21b-M重組菌，按1∶100比例接種于氨芐抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床中過(guò)夜活化。次日按1∶50轉(zhuǎn)入大試管，大量搖菌后使用試劑盒提取質(zhì)粒，測(cè)定濃度和純度后存于-20℃。將測(cè)定的質(zhì)粒濃度代入公式[(6.02×1023)×(mg/L×10-9)/(DNA length×660)=copies/μL]計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成在NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Purdue P115(DQ811788.1),Miller M6(DQ811785.1),TH-98(KU729220.1),JS2012(KT 696544),SC-Y(DQ517438.1),WH-1(HQ462571.1)等TGEV毒株[8-9]的M基因序列。利用軟件DNAMAN v6.0進(jìn)行序列比對(duì)，篩選6個(gè)序列高度保守的區(qū)域并M基因全長(zhǎng)導(dǎo)入Primer Explorer V4(http://primerexplorer.jp/e)在線設(shè)計(jì)引物。根據(jù)和M基因序列比對(duì)結(jié)果，挑選引物序列均處于M基因高度保守區(qū)域的F3,B3,FIP,BIP，并以pET-21b-M質(zhì)粒為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，選取最佳引物對(duì)。同時(shí)采用 Prime Premier 6.0軟件分別根據(jù)TGEV M和N基因設(shè)計(jì)進(jìn)行PCR檢測(cè)的引物，引物全部由蘇州金維智生物科技有限公司合成(表1)，括號(hào)中的數(shù)字為引物在目標(biāo)序列上對(duì)應(yīng)的位置，將合成的引物配制成10 μmol/L，分裝后置于-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物信息

1.5 病毒增殖與核酸提取復(fù)蘇并用T25細(xì)胞瓶培養(yǎng)ST細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)80%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次，取保存的病毒液500 μL接種于單層細(xì)胞，37℃吸附1 h后，加入含2%犢牛血清的DMEM維持液4 mL，5% CO2,37℃條件下培養(yǎng)48～72 h，每日觀察細(xì)胞病變情況。待70%～80%的細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE時(shí)收獲病毒液，參照EasyPure?Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA。使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit，以提取的病毒RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，10 μL反轉(zhuǎn)錄體系包括5×PrimeScript Buffer 2.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL，Oligo dT Primer (50 μmol/L) 0.5 μL，Total RNA 1 000 ng，用DEPC水補(bǔ)足10 μL。37℃反應(yīng)15 min；85℃ 5 s 終止反應(yīng)，4℃保存。得到的cDNA直接用于后續(xù)研究或置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TGEV LAMP檢測(cè)方法的建立

1.6.1反應(yīng)條件優(yōu)化 采用LAMP方法通用的25 μL 反應(yīng)體系分別加入：模板DNA 1～4 μL，引物F3,B3,FIP,BIP，10×BstDNA Polymerase Buffer，dNTPs(10 mmol/L)，Betaine(5 mol/L)，MgSO4(250 mmol/L)，BstDNA Polymerase(8 U/μL)，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)溫度分別設(shè)置為60,61,62,63,64和65℃，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為15,30,45,60 min，并以ddH2O為陰性對(duì)照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)產(chǎn)物電泳條帶確定最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間。

1.6.2反應(yīng)體系優(yōu)化 分別對(duì)內(nèi)、外引物濃度比,dNTP,Mg2+,甜菜堿濃度進(jìn)行篩選。分別設(shè)定內(nèi)、外引物(F3/B3與FIP/BIP)濃度比為1∶4,1∶6,1∶8,1∶10；dNTPs 終濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L；Mg2+終濃度為2,4,6,8,10,12 mmol/L；Betaine終濃度分別為0.2，0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mol/L，按確定的最佳反應(yīng)條件依次進(jìn)行LAMP反應(yīng)，根據(jù)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確定最佳反應(yīng)體系。

1.7 LAMP可視化檢測(cè)條件優(yōu)化根據(jù)確定的最佳反應(yīng)條件和最佳反應(yīng)體系，在反應(yīng)前向反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍(lán)指示液(5 mmol/L)，設(shè)置加入量分別為0,0.5,1.0,1.5,2.0 μL的5個(gè)陽(yáng)性管進(jìn)行LAMP反應(yīng)。在陰性對(duì)照成立的情況下，通過(guò)反應(yīng)前后顏色變化選擇最佳的顯色條件，并同步用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證可視結(jié)果的可靠性。

1.8 LAMP方法特異性試驗(yàn)分別以提取的TGEV,PEDV,PoRV,PPV,PRRSV,PCV2的核酸為模板，按照已建立的LAMP體系，加入合適濃度的HNB指示劑對(duì)進(jìn)行可視化檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后觀察顏色變化，同時(shí)取適量反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證已建立LAMP方法的特異性。

1.9 LAMP方法敏感性試驗(yàn)將1.3步驟獲得的pET-21b-M質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑥?.7×1010個(gè)拷貝/μL稀釋到3.7×100個(gè)拷貝/μL，以不同濃度質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并添加HNB指示劑顯色判斷其靈敏度。同時(shí)以不同稀釋度的質(zhì)粒為模板，用引物F-TGEV-M和R-TGEV-M進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)兩種方法檢測(cè)的靈敏度進(jìn)行對(duì)比。

1.10 臨床樣本檢測(cè)采用建立的可視化RT-LAMP方法，對(duì)從陜西,寧夏及山東等地豬場(chǎng)收集的42份小豬腹瀉樣品進(jìn)行TGEV檢測(cè)，觀察反應(yīng)前后顏色變化，確定樣品的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)以樣品cDNA為模板，用F-TGEV-Nt和R-TGEV-Nt與F-PEDV-Mt和R-PEDV-Mt進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)兩種方法檢測(cè)TGEV的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 TGEV檢測(cè)RT-LAMP最佳引物篩選結(jié)果按照LAMP引物設(shè)計(jì)要求和TGEV M基因序列比對(duì)結(jié)果，共挑選了5組引物，以pET-21b-M質(zhì)粒為模板，在63℃反應(yīng)60 min進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果采用引物對(duì)1,2,3,5都可以擴(kuò)增到梯度條帶，采用引物對(duì)4沒(méi)有擴(kuò)到目的條帶，陰性對(duì)照成立。根據(jù)條帶的整齊度和清晰度選擇引物對(duì)3建立檢測(cè)方法(圖1)，其序列見(jiàn)表1所示。

圖1 5對(duì)引物L(fēng)AMP擴(kuò)增結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker；1～5.引物對(duì)1～5；6.陰性對(duì)照

2.2 RT-LAMP最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系的確定以選定的引物對(duì)，分別設(shè)置反應(yīng)溫度為60,61,62,63,64和65℃，反應(yīng)時(shí)間為15,30,45,60 min，并以ddH2O為陰性對(duì)照，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。結(jié)果顯示，在60～65℃反應(yīng)，均能擴(kuò)增到梯狀條帶，以在63℃擴(kuò)增的梯狀條帶最清楚(圖2A)；63℃擴(kuò)增30 min即出現(xiàn)梯狀條帶，但擴(kuò)增45,60 min出現(xiàn)的梯狀條帶亮度與清晰度更好(圖2B)，為節(jié)省時(shí)間，選擇擴(kuò)增時(shí)間為45 min。

圖2 RT-LAMP方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 A.反應(yīng)溫度；B.反應(yīng)時(shí)間; M.DL2000 DNA Marker；NC.陰性對(duì)照

根據(jù)確定的在63℃反應(yīng)45 min，分別對(duì)內(nèi)外引物(F3/B3與FIP/BIP)濃度比,dNTP,Mg2+,甜菜堿濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選。最終確定內(nèi)外引物比為1∶6,Mg2+終濃度在4 mmol/L時(shí)擴(kuò)增的梯狀條帶最清楚(圖3A,C)，dNTPs終濃度為從0.4 mmol/L開(kāi)始差別不明顯(圖3B)，Betaine(5 mol/L)的添加量在1,2,3,4,5和6 μL，即終濃度為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2 mol/L時(shí)，梯狀條帶的亮度與清晰度差別不明顯(圖3D)，考慮加樣的準(zhǔn)確性和節(jié)省原則，選擇dNTPs和Betaine終濃度均為0.4 mol/L。

圖3 RT-LAMP方法反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果 A.內(nèi)、外引物濃度比例；B.dNTPs濃度；C.Mg2+濃度；D.Betaine濃度；M.DL2000 DNA Marker；NC.陰性對(duì)照

2.3 可視化顯色條件篩選確定了RT-LAMP的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系后，反應(yīng)前向反應(yīng)體系中加入HNB顯色劑，反應(yīng)管中顯示紫羅蘭色，若陽(yáng)性模板存在，反應(yīng)后即變?yōu)樘焖{(lán)色。從圖4A和圖4B可以看出，相比于HNB終濃度為300,400 μmol/L的反應(yīng)管，100,200 μmol/L的反應(yīng)管反應(yīng)前后顏色變化更明顯，但HNB終濃度為100 μmol/L時(shí)，顯色結(jié)果易受自然光影響，因此選擇HNB使用量為終濃度200 μmol/L。同時(shí)，隨機(jī)取幾個(gè)可視化陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物與陰性對(duì)照產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖4C)，證實(shí)可視化檢測(cè)方法成立且結(jié)果可信。

圖4 RT-LAMP方法反應(yīng)體系中HNB使用量?jī)?yōu)化結(jié)果 A.反應(yīng)前顏色；B.反應(yīng)后顏色；C.瓊脂糖凝膠電泳；M.DL2000 DNA Marker；NC.陰性對(duì)照

2.4 LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果分別以TGEV,PEDV,PoRV,PPV,PRRSV,PCV2的RNA或DNA為模板，采用建立的RT-LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在反應(yīng)前向反應(yīng)管加入HNB，反應(yīng)結(jié)束觀察顏色變化，并取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果僅以TGEV RNA為模板的反應(yīng)管和陽(yáng)性對(duì)照一致，由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色，其他反應(yīng)管都與陰性對(duì)照反應(yīng)管一樣沒(méi)有顏色變化(圖5A)。電泳結(jié)果顯示僅陽(yáng)性對(duì)照和以TGEV RNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)特異性梯狀條帶，其他均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖5B)，表明建立的檢測(cè)TGEV的RT-LAMP方法特異性良好。

圖5 RT-LAMP方法特異性試驗(yàn)結(jié)果 A.HNB顯色；B.瓊脂糖凝膠電泳；M.DL2000 DNA Marker；PC.陽(yáng)性對(duì)照；NC.陰性對(duì)照

2.5 LAMP靈敏度試驗(yàn)結(jié)果將pET-21b-M質(zhì)粒從3.7×1010個(gè)拷貝/μL稀釋到3.7×100個(gè)拷貝/μL作為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，并添加HNB顯色以判斷其靈敏度。同時(shí)以不同稀釋度的質(zhì)粒為模板，用引物F-TGEV-M和R-TGEV-M進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)比LAMP方法和PCR方法的靈敏度。結(jié)果顯示，使用LAMP方法最低檢測(cè)限為3.7×103個(gè)拷貝(圖6A,6B)，而常規(guī)PCR方法的最低檢出限為3.7×105個(gè)拷貝(圖6C)，LAMP方法的靈敏度比常規(guī)PCR方法高100倍。在反應(yīng)體系中加入HNB對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)一致(圖6A)。說(shuō)明建立的LAMP方法靈敏度比常規(guī)PCR高。

圖6 RT-LAMP方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果 A.HNB顯色；B.瓊脂糖凝膠電泳；C.常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；M.DL2000 DNA Marker；NC.陰性對(duì)照

2.6 臨床樣品檢測(cè)采用建立的可視化RT-LAMP方法對(duì)42份仔豬腹瀉小腸及糞便拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。部分樣品檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，采用可視化RT-LAMP方法檢測(cè)TGEV的結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致，兩者符合率100%。

圖7 部分臨床樣品RT-LAMP檢測(cè)結(jié)果 A.HNB顯色；B.瓊脂糖凝膠電泳；NC.陰性對(duì)照；PC.陽(yáng)性對(duì)照；1～8.臨床樣品1～8號(hào)

表2顯示了42份臨床腹瀉仔豬樣品檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)情況，采用可視化RT-LAMP方法共檢出TGEV陽(yáng)性樣品21份，采用RT-PCR方法共檢出TGEV陽(yáng)性樣品4份，這4份樣品有3份存在于RT-LAMP檢測(cè)的21份陽(yáng)性樣品中(樣品編號(hào)2,28,33)，3號(hào)樣品RT-LAMP檢測(cè)為陰性，而RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，表明建立的可視化RT-LAMP方法敏感性高于RT-PCR方法。同時(shí)對(duì)這些樣品進(jìn)行了PEDV檢測(cè)，共檢出PEDV陽(yáng)性22份，28和33號(hào)樣品3種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，有10份樣品(16,17,18,19,22,25,30,32,35,39號(hào))TGEV RT-LAMP和PEDV RT-PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，說(shuō)明這些腹瀉仔豬中存在TGEV和PEDV混合感染情況，有10份樣品(4,7,8,12,14,15,26,36,38,42號(hào))3種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，這些仔豬的腹瀉可能是其他原因造成，需要進(jìn)行其他病原的檢測(cè)。

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論

目前在全國(guó)范圍內(nèi)，雖然豬傳染性胃腸炎大區(qū)域流行十分少見(jiàn)，但常與豬流行性腹瀉,輪狀病毒病等混合感染，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)潛在危害嚴(yán)重[10]。常用的檢測(cè)TGEV的方法主要有傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以及新型的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，每種方法優(yōu)缺點(diǎn)并存[11-12]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，結(jié)果精確率高，檢測(cè)需要時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；分子生物學(xué)檢測(cè)方法常常需要配備一定的儀器設(shè)備，基層使用受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，大大節(jié)省了送測(cè)時(shí)間，也無(wú)需購(gòu)買(mǎi)過(guò)于昂貴的儀器與試劑，操作方法簡(jiǎn)單易懂，對(duì)基層檢測(cè)十分適用。CHEN等[13-15]先后建立的TGEV LAMP檢測(cè)方法，都是根據(jù)病毒的N基因保守區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)特異性引物的，目前未見(jiàn)報(bào)道以TGEV M基因?yàn)榘谢蚪GEV的LAMP檢測(cè)方法的研究。M蛋白在病毒粒子裝配環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，其羧基端作為病毒免疫顯性區(qū)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體依賴(lài)性中和抗體引發(fā)細(xì)胞補(bǔ)體溶解反應(yīng)[16]。張小波等[17]對(duì)TGEV HB06株與TS株,Purdue-115株,TFI株和H16株的M基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，M基因具有很好的保守性。本研究對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中TGEV Purdue P115(DQ811788.1),Miller M6(DQ811785.1),TH-98(KU729220.1),JS2012(KT 696544),SC-Y(DQ517438.1),WH-1(HQ462571.1)等常見(jiàn)毒株的M基因進(jìn)行比對(duì)的基礎(chǔ)上，選擇其高度保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)TGEV的RT-LAMP方法，并且對(duì)LAMP檢測(cè)體系中各組分的使用濃度進(jìn)行了細(xì)化篩選，不僅能夠在1 h內(nèi)完成LAMP檢測(cè)反應(yīng)，而且靈敏度比普通PCR方法高100倍。

目前，LAMP檢測(cè)方法可通過(guò)3種方式來(lái)判定結(jié)果：核酸電泳,副產(chǎn)物焦磷酸鎂濁度觀察或曲線測(cè)定,核酸染料或化學(xué)試劑可視化檢測(cè)。通過(guò)核酸電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)需要開(kāi)蓋操作，由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物通常是瀑布式增長(zhǎng)的，極易出現(xiàn)操作環(huán)境污染造成的假陽(yáng)性；通過(guò)沉淀濁度判定時(shí)，為防誤判一般需要使用濁度分析儀，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)成本上升。因此采用染料顏色對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化顯示已經(jīng)得到臨床基層檢測(cè)人員的廣泛青睞，這種方法同時(shí)還具備方便靈敏和容易辨別的優(yōu)勢(shì)。

使用熒光染料SYBR Green,PicoGreen等染料時(shí)，這些染料會(huì)與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合，但往往引物二聚體會(huì)對(duì)熒光結(jié)果有較大影響，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性，而且這些染料需要在擴(kuò)增后開(kāi)蓋加入，易造成氣溶膠污染[18]。鈣黃綠素是一種鎂離子指示劑，在反應(yīng)前就可加入體系，無(wú)需開(kāi)蓋，后來(lái)被日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)使用[19]，但是這種方法需要摸索鈣黃綠素與Mn2+的合適配比，而且Mn2+對(duì)LAMP檢測(cè)靈敏度影響較大。金屬離子指示劑羥基萘酚藍(lán)于2009年由GOTO等[20]首次采用，后來(lái)不斷被證實(shí)它既能實(shí)現(xiàn)閉管操作，而且不影響擴(kuò)增過(guò)程，結(jié)果可視化效果較好[21-22]。該金屬離子指示劑在有Mg2+的反應(yīng)體系中呈紫羅蘭色，隨著反應(yīng)體系中Mg2+因形成焦磷酸鎂沉淀的消耗，反應(yīng)體系顏色由紫羅蘭色轉(zhuǎn)變?yōu)樘焖{(lán)色，而陰性對(duì)照仍保持紫羅蘭色。HNB指示劑在反應(yīng)前即加入反應(yīng)體系中，避免了開(kāi)蓋檢測(cè)可能造成的氣溶膠污染，并且它對(duì)LAMP反應(yīng)的敏感度無(wú)影響。本研究通過(guò)優(yōu)化篩選HNB適合的工作濃度，確定了其使用終濃度為200 μmol/L時(shí)顯色效果最佳。

使用本研究建立的LAMP方法檢測(cè)收集的臨床仔豬腹瀉樣品，結(jié)果顯示所建立的可視化RT-LAMP方法檢測(cè)TGEV陽(yáng)性率高，而普通PCR檢測(cè)TGEV陽(yáng)性率較低，同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行PEDV的RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28和33號(hào)樣品3種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性；有10份樣品TGEV RT-LAMP和PEDV RT-PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，說(shuō)明這些仔豬存在TGEV和PEDV混合感染情況。有10份樣品3種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，這些仔豬的腹瀉可能是其他原因造成，要確定具體原因需要進(jìn)行其他病原的檢測(cè)，如PoRV檢測(cè)等。目前，國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)由于受非洲豬瘟的嚴(yán)重影響，本次研究收集的臨床腹瀉樣品數(shù)有限，要想進(jìn)一步開(kāi)發(fā)推廣使用該方法，還需收集大批量的樣品進(jìn)行測(cè)試，以對(duì)建立的方法進(jìn)行更深入評(píng)價(jià)。