小麥ABA受體基因TaPYL9的克隆和表達(dá)分析

徐園園，趙 鵬，劉冬梅，朱曉琴，賈方方，裴冬麗

(1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院/植物與微生物互作河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 商丘 476000；2.商丘師范學(xué)院 人文學(xué)院，河南 商丘 476000)

脫落酸(ABA)在植物生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答中具有重要的作用，可形成一個復(fù)雜的信號通路來抵御植物生長過程中遇到的干旱、高鹽和低溫等各種非生物脅迫[1-2]。ABA信號通路包含3個組成部分：ABA 受體PYR/PYL/RCAR(Pyrabactin resistance/Pyrabactin resistance like/Regulatory component of ABA receptor)、負(fù)調(diào)控因子2C 類蛋白磷酸酶(Protein phosphatase 2C，PP2C)和正調(diào)控因子蔗糖非酶解型蛋白激酶(Sucrose non-fermenting1-related protein kinase，SnRK2)，它們在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中共同組成了一個雙重的負(fù)調(diào)控系統(tǒng)，PYR/PYL/RCAR 負(fù)調(diào)控 PP2C，而 PP2C 又負(fù)調(diào)控SnRK2[3]。在正常的生長條件下，PP2C 通過去磷酸化作用使 SnRK2 失活，ABA 信號保持沉默；一旦外界環(huán)境條件或本身發(fā)育信號誘導(dǎo)植物產(chǎn)生 ABA 之后，ABA 結(jié)合PYR/PYL/RCAR并促使其與 PP2C 相互作用，抑制 PP2C 的活性，解除 PP2C 對SnRK2 的抑制，SnRK2 被激活后磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子或膜蛋白等，開啟 ABA 信號反應(yīng)[4-5]。其中ABA 受體PYR/PYL/RCAR是 ABA 信號通路最上游的調(diào)控因子，承擔(dān)著識別 ABA 信號和啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[6]。

PARK等[7]最先發(fā)現(xiàn)PYL家族，他們用種子萌發(fā)抑制劑Pyrabactin處理擬南芥(Arabidopsisthaliana)，篩選出了抗Pyrabactin突變株，從中分離得到PYR1基因及13個PYR1同源基因，命名為PYR1—PYL13(PYR-like)，并發(fā)現(xiàn)PYR1蛋白可特異結(jié)合ABA。同時MA等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PYR/PYL/RCAR家族成員可以結(jié)合ABA，抑制ABI1或者ABI2 的活性。隨后關(guān)于PYL的結(jié)構(gòu)和功能研究越來越深入，在結(jié)構(gòu)上PYL家族成員都有1個高度相似的螺旋手柄結(jié)構(gòu)，由2個α-螺旋和7個β-折疊組成，另外，PYL家族成員在N端都有1個α-螺旋結(jié)構(gòu)[9-10]。目前，在擬南芥中PYR/PYL/RCAR家族有14個成員，根據(jù)序列差異可分為3個亞族，第Ⅰ亞族包括 PYL7、PYL8、PYL9、PYL10，第Ⅱ亞族包括 PYL4、PYL5、PYL6、PYL11、PYL12、PYL13，第Ⅲ亞族包含 PYR1、PYL1、PYL2、PYL3[11]。

PYL能夠調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，PYL9對ABA信號敏感[12]，能調(diào)控干旱脅迫和葉片生長[13]，并且能和PYL8共同調(diào)控擬南芥?zhèn)雀纳L[14]。在水稻中過表達(dá)OsPYL9基因，轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)對ABA敏感[15]。在番茄中，SlPYL1、SlPYL2、SlPYL4、SlPYL5、SLPYL7、SlPYL8、SlPYL9、SlPYL10、SlPYL11和SlPYL13是ABA依賴型受體基因，而SlPYL3和SlPYL12是非ABA依賴型受體基因，其中SlPYL1、SlPYL2、SlPYL8、SlPYL10基因在ABA脅迫下上調(diào)表達(dá)[16]。對于玉米PYL家族成員，ZmPYL3、ZmPYL9、ZmPYL10和ZMPYL13基因的過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA的敏感性，過表達(dá)ZmPYL8、ZmPYL9和ZmPYL12基因的轉(zhuǎn)基因株系抗旱性增強(qiáng)[17]。在小麥中關(guān)于ABA受體的研究也有一些進(jìn)展，TaPYL13基因在ABA和鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)[18]，TaPYL2和TaPYL6基因響應(yīng)鹽脅迫[19]。但是到目前為止，尚未見到關(guān)于TaPYL9基因的報道。為此，通過同源克隆方法獲得小麥ABA受體基因TaPYL9，通過生物信息學(xué)方法分析其序列特征，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法研究其在NaCl、ABA和PEG下的表達(dá)模式，以期為小麥ABA信號響應(yīng)和抗旱研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料及培養(yǎng)

供試小麥品種為矮抗58。小麥種子置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(22 ℃，16 h光照)。一葉一心時分別用250 mmol/L NaCl、50 mmol/L ABA、15% PEG4000溶液進(jìn)行處理，分別在處理0、3、6、12、24 h時取小麥幼苗葉片，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

采用Trizol法提取小麥葉片總RNA。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa公司)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3 TaPYL9基因克隆

以擬南芥AtPYL9基因序列搜索小麥EST 數(shù)據(jù)庫，用EST序列進(jìn)行電子延伸獲得目標(biāo)基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA序列信息設(shè)計擴(kuò)增引物,F:5′-GAACCCACCAAACCGATTAGC-3′和R:5′-CGAGGAGAACTCTTCCACCAAT-3′，以小麥cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：KOD-plus-Neo 1μL，10×KOD-plus-Neo buffer 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO45 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加ddH2O至總體積50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，擴(kuò)增35個循環(huán)?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，連接T克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒DNA，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 TaPYL9基因的生物信息學(xué)分析

用Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測基因的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列。使用Protparam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)對氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。通過NCBI在線分析工具Conserved domains分析氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域。利用NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，找出與TaPYL9同源性最高的8個PYL蛋白，采用DANMAN進(jìn)行多重序列比對。采用MEGA 7.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用MEME在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)分析TaPYL9和其他植物PYLs氨基酸序列的保守基序(Motif)差異，Motif數(shù)目設(shè)置為10，其他為默認(rèn)設(shè)置。

1.5 qRT-PCR分析

根據(jù)目的基因TaPYL9序列和小麥看家基因β-actin(GenBank:AB181991.1)設(shè)計qRT-PCR所需的目的基因引物TaPYL9YG-F、TaPYL9YG-R和內(nèi)參基因引物actin-F、actin-R。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物信息Tab.1 The primers information of qRT-PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理

qRT-PCR 試驗(yàn)進(jìn)行 3 次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù) 4 個技術(shù)重復(fù)。目標(biāo)基因在模板中的相對表達(dá)量用 2-ΔΔCt計算，使用IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行方差分析，使用Excel 2007制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaPYL9基因的克隆

以小麥cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長度稍大于1 000 bp的DNA片段(圖1)，測序得到長度為1 173 bp的序列，其開放閱讀框長618 bp，編碼205個氨基酸殘基。

1:Marker 2000；2:Marker 15000；3:TaPYL9基因PCR 產(chǎn)物

2.2 TaPYL9蛋白序列及結(jié)構(gòu)分析

對TaPYL9蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其分子質(zhì)量為22 218.06 u，等電點(diǎn)為5.79，負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)數(shù)為26，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為21，不穩(wěn)定指數(shù)為47.47，為不穩(wěn)定蛋白。在氨基酸組成上，以Val (V)含量最高，為11.2%，其次為Gly (G，9.3%)，第3位為Leu (L，8.8%)，脂溶性指數(shù)為 89.32，親水性系數(shù)為 -0.220，為親水蛋白。對TaPYL9蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，α-螺旋占41.46%，延伸鏈占18.05%，β-轉(zhuǎn)角占5.37%，無規(guī)則卷曲占35.12%。預(yù)測該蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有典型的PYL螺旋手柄結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有2個α-螺旋和7個β-折疊(圖2)。對TaPYL9蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其含有1個PYR/PYL/RCAR like家族結(jié)構(gòu)域(圖3)，該家族屬于SRPBCC(START/RHO alpha_C/PITP/Bet_v1/CoxG/CalC)超家族，該超家族結(jié)構(gòu)域中有1個深口袋狀的疏水配體結(jié)合囊，能夠結(jié)合ABA等多種配體。

圖2 TaPYL9蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.3 TaPYL9蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，TaPYL9蛋白與其他植物的PYL蛋白的相似性較高，其中與山羊草(Aegilopsspeltoides)AsPYL9-like(XP_020194954.1) 和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdPYL8(XP_003568737.1)氨基酸序列的同源性最高，分別為99%和90%。選取前8個同源性較高的序列進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)這些序列在C端同源性較高，N端具有較大的可變性(圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，TaPYL9和AsPYL9-like親緣關(guān)系最近，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)13個PYL家族成員中的AtPYL7、AtPYL8、AtPYL9、AtPYL10親緣關(guān)系較近，其中，與AtPYL9最近，屬于1個亞族，與其他擬南芥PYL家族成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。

圖3 TaPYL9 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

AsPYL9-like：XP_020194954.1；BdPYL8：XP_003568737.1；FePYL5 (Festuca elata PYL5)：ATP66592.1；OsPYL5(Oryza sativa PYL5)：XP_015640707.1；ObPYL8-like(Oryza brachyantha PYL8-like)：XP_006655099.1；Oryza sativa ABA receptor 5：AIX10793.1；SiPYL8(Setaria italica PYL8)：XP_004960624.1；DoPYL8 (Dichanthelium oligosanthes PYL8)：OEL21558.1

2.4 TaPYL9蛋白Motif分析

選取系統(tǒng)進(jìn)化分析中與TaPYL9同一亞族的部分PYL，包括擬南芥ABA受體AtPYL7(Q1ECF1.1)、AtPYL8(Q9FGM1.1)、AtPYL9(Q84MC7.1)、AtPYL10(Q8H1R0.1)和AsPYL9-like(XP_020194954.1)、FePYL5(ATP66592.1)、SiPYL8(XP_004960624.1)、DoPYL8(OEL21558.1)、TaPYL9共9個PYL蛋白進(jìn)行Motif分析。由圖6可知，TaPYL9包含7個Motif，其中Motif1、Motif2、Motif3和Motif4是所檢測的9個PYL蛋白共有的。Motif5是TaPYL9、AsPYL9-like、FePYL5、SiPYL8、DoPYL8、AtPYL9共有的，擬南芥的其他3個PYL蛋白不存在。Motif6在TaPYL9、AsPYL9-like、FePYL5、SiPYL8、DoPYL8中存在，擬南芥的4個PYL中都不存在。Motif9是TaPYL9和AsPYL9-like所特有的，其他幾個PYL蛋白中均沒有。TaPYL9和AsPYL9-like含有相同的Motif，說明它們的氨基酸序列結(jié)構(gòu)最相似。在擬南芥的4個PYLs蛋白中，AtPYL9和TaPYL9的Motif相似性最高，這和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果相同，再次證明TaPYL9和AtPYL9親緣關(guān)系最近，可能具有相同的生物學(xué)功能。

圖5 TaPYL9蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖6 TaPYL9蛋白Motif分析

2.5 TaPYL9基因表達(dá)分析

在ABA處理下，TaPYL9表達(dá)量總體呈先上升后下降再上升的趨勢，處理6 h時，表達(dá)量上升為原來的1.5倍；處理12 h時，表達(dá)量下降為原來的3/5；隨后表達(dá)量上升，到24 h時，表達(dá)量增加為原來的2.3倍(圖7)。TaPYL9對ABA處理敏感，屬于ABA依賴型受體。

在NaCl處理下，TaPYL9表達(dá)量總體呈先下降后上升再下降再上升的趨勢，在處理3 h時，表達(dá)量下降到處理前的3/5，隨后表達(dá)量增加；在處理6 h時，表達(dá)量增加至原來的2.1倍；隨后緩慢下降，但仍然比處理前高，在24 h時，表達(dá)量為處理前的1.7倍，表明TaPYL9可能參與調(diào)控小麥鹽脅迫應(yīng)答(圖7)。

在PEG模擬的干旱處理下，TaPYL9表達(dá)量呈波動式上升趨勢，在處理3 h時，表達(dá)量下降為原來的2/5；隨后緩慢上升，在處理12 h時，又略微下降，但隨后迅速上升；在處理24 h時，表達(dá)量為處理前的2.7倍(圖7)，表明該基因可能參與調(diào)控小麥干旱脅迫應(yīng)答。

不同小寫字母表示不同處理時間的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

PYR/PYL/RCAR家族是ABA信號通路的關(guān)鍵組成部分，能夠識別ABA信號并結(jié)合ABA啟動ABA信號通路從而調(diào)控植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答。本研究從普通小麥品種矮抗58中分離得到了1個PYL家族成員TaPYL9，該基因編碼205個氨基酸殘基，TaPYL9蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白，與木薯和馬鈴薯PYL8相似[20-21]。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明，TaPYL9蛋白以α-螺旋為主；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白包含一個由2個α-螺旋和7個β-折疊組成的螺旋手柄結(jié)構(gòu)，符合PYL家族成員的典型結(jié)構(gòu)特征[9-10]。功能域分析也表明，TaPYL9蛋白具有PYL家族的PYR/PYL/RCAR like功能域，TaPYL9可能是PYL家族成員。TaPYL9與其他植物PYL家族成員例如二穗短柄草BdPYL8(XP_003568737.1)、山羊草AsPYL9-like(XP_020194954.1)同源性較高，進(jìn)一步證明其為PYL家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TaPYL9蛋白和AsPYL9-like親緣關(guān)系最近，和擬南芥家族中的AtPYL7、AtPYL8、AtPYL9、AtPYL10同屬于第Ⅰ亞族，其中與AtPYL9親緣關(guān)系最近，而AtPYL4、AtPYL5、AtPYL6、AtPYL11、AtPYL12、AtPYL13屬于第Ⅱ亞族，AtPYL1、AtPYL2、AtPYL3屬于第Ⅲ亞族，這與前人對擬南芥PYL家族的分組情況研究結(jié)果相同[11]。Motif分析也證明在擬南芥PYL蛋白中，AtPYL9和TaPYL9蛋白Motif的相似性最高，這和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果相同，再次證明TaPYL9和AtPYL9親緣關(guān)系最近，可能具有相同的生物學(xué)功能。

AtPYL9參與ABA信號通路，對ABA信號敏感，能夠調(diào)控干旱脅迫[12-13]，同時水稻和番茄中的研究也證明PYL9對ABA敏感，能夠調(diào)控ABA信號通路[15-16]。玉米ZmPYL9能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性[17]。把棉花GhPYL9-11A基因轉(zhuǎn)化擬南芥表明，GhPYL9-11A基因促進(jìn)了幼苗根系生長，提高了抗旱基因的表達(dá)量[22]。因此，推測TaPYL9可能參與ABA信號通路，能夠調(diào)控小麥逆境脅迫響應(yīng)，基于此本研究用qRT-PCR方法分析了TaPYL9基因在ABA、PEG和NaCl處理下的表達(dá)模式，在3種處理下該基因均上調(diào)表達(dá)，表明TaPYL9可能在調(diào)控小麥ABA信號通路中具有重要的作用，可能參與小麥非生物脅迫應(yīng)答的調(diào)控，關(guān)于其調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。